Indução da Inflamação Intestinal por Transferência Adotiva de Células CD4+ T Transgênicas CBir1 T para camundongos imunodeficientes
Summary
Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.
Abstract
Com o aumento da incidência, as doenças inflamatórias intestinais (DII), que são doenças crônicas que afetam o trato gastrointestinal, impõem uma considerável carga sanitária e financeira aos indivíduos e à sociedade. Por isso, é fundamental investigar os mecanismos subjacentes à patogênese e ao desenvolvimento do IBD. Aqui, um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal é descrito. CBir1 flagellin foi reconhecido como o antígeno bacteriano intestinal imunodominante em colite experimental e pacientes com doença de Crohn. As células CD4+ T transgênicas CBir1 T, específicas do CBir1 flagellin, podem induzir colite crônica após transferência adotiva para rag1-/- camundongos deficientes imunológicos. A gravidade da doença é avaliada pela histopatologia. Os fenótipos de células T CD4+ em lavíria lamina colonia também são determinados. Este modelo se assemelha muito ao desenvolvimento do IBD, que fornece um modelo murino ideal para investigar os mecanismos que conduzem a patogênese do IBD e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.
Introduction
As doenças inflamatórias intestinais (DII), principalmente incluindo a doença de Crohn (CD) e a colite ulcerativa (UC), são caracterizadas pela inflamação crônica, reencenando-reencenação do trato gastrointestinal, afetando milhões em todo o mundo1. Vários fatores foram implicados no desenvolvimento e na patogênese do DII, incluindo suscetibilidade genética, microbiota intestinal, respostas imunes, dieta e estilo de vida2. No entanto, o mecanismo exato do IBD ainda não é completamente compreendido.
Um dos interesses particulares é a interação entre microbiota intestinal e respostas imunes hospedeiras na regulação da inflamação intestinal3. A microbiota intestinal fornece uma série de moléculas imunoestimulatórias e antígenos, que podem ativar as respostas imunológicas4. Enquanto o equilíbrio entre células T effector e células T regulatórias (Tregs) é fundamental na manutenção da homeostase intestinal, a resposta excessiva das células T mucosas intestinais à microbiota intestinal contribui para inflamação intestinal5,6,7. Como um antígeno de microbiota intestinal imunodominante, cBir1 flagellin tem sido relacionado com a patogênese do CD8,9 humano. Além disso, a transferência de células T transgênicas CBir1 TCR (Tg) induz inflamação intestinal em camundongos imuno-deficientes6, assemelhando-se intimamente ao IBD humano, indicando que este modelo de transferência de células T ajuda a investigar os mecanismos do IBD humano.
Este trabalho descreve o protocolo detalhado de indução de colite em Rag1-/- camundongos por transferência adotiva de células CD4+ T CBir1 Tcr t e avaliação da gravidade da doença. Além disso, os resultados antecipados são mostrados, e são discutidas as etapas críticas do procedimento e solução de problemas, que ajudarão os pesquisadores a investigar os mecanismos da patogênese da inflamação intestinal e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora cada passo seja essencial para a reprodutibilidade desse modelo de colite, existem várias etapas críticas. Os camundongos rag-/- receptores devem receber células INV4+ inválidas adequadas para induzir inflamação intestinal. Usamos baços para o isolamento de células T CD4+ ingênuas em vez de MLNs. Porque o rendimento de células T CD4+ ingênuas em MLNs é muito menor do que em baços. CD62L é altamente expresso em células T ingênuas, e CD44 e CD25 s?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pelos subsídios do National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, o prêmio STARs do Sistema da Universidade do Texas (Y.C.), e o James W. McLaughlin Fellowship Fund da University of Texas Medical Branch em Galveston (W.Y.). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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