Induktion av tarminflammation genom adoptivöverföring av CBir1 TCR Transgena CD4 + T-celler till immunodeficient möss
Summary
I detta protokoll beskrivs en gut microbiota antigen-specifika T cell adoptiv överföring kolit modell. CD4+ T-celler är isolerade från CBir1 TCR transgena möss. Dessa är specifika för ett immunodominant tarmmikrobiotaantigen CBir1 flagellin, som överförs till mottagaren Rag1-/- möss, vilket leder till tarminflammation.
Abstract
Med ökningen av incidensen medför inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), som är kroniska sjukdomar som påverkar mag-tarmkanalen, en betydande hälso- och ekonomisk börda för individer och samhälle. Därför är det viktigt att undersöka mekanismerna bakom patogenesen och utvecklingen av IBD. Här beskrivs en gut microbiota antigen-specifika T cell överföring kolit modell. CBir1 flagellin har erkänts som immunodominant gut bakteriell antigen i experimentell kolit och patienter med Crohns sjukdom. CBir1 TCR transgena nave CD4 + T-celler, specifika för CBir1 flagellin, kan inducera kronisk kolit efter adoptivöverföring till immunbrist Rag1-/- möss. Sjukdomen allvarlighetsgrad bedöms av histopatologi. CD4 + T cell fenotyper i colonic lamina propria bestäms också. Denna modell liknar nära utvecklingen av IBD, som ger en idealisk murin modell för att undersöka mekanismerna som driver patogenesen vid IBD och testa de potentiella läkemedlen för behandling av IBD.
Introduction
Inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), främst inklusive Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC), kännetecknas av kronisk, skovvis förlöpande inflammation i mag-tarmkanalen, som påverkar miljontals över hela världen1. Flera faktorer har varit inblandade i utvecklingen och patogenesen vid IBD, inklusive genetisk känslighet, tarmfloran, immunsvar, kost och livsstil2. Den exakta mekanismen för IBD är dock fortfarande inte helt förstådd.
Ett av de särskilda intressena är interaktionen mellan tarmfloran och värd immunsvar vid reglering av tarminflammation3. Tarmfloran ger en serie immunstimulerande molekyler och antigener, som kan aktivera immunsvar4. Medan balansen mellan effektor T-celler och regulatoriska T-celler (Tregs) är avgörande för att upprätthålla intestinal homeostas, bidrar det överdrivna intestinala mukosala CD4 + T-cellssvaret på tarmmikrobiotaantigener till tarminflammation5,6,7. Som immunodominant tarm microbiota antigen, CBir1 flagellin har varit relaterade till patogenesen vid mänskliga CD8,9. Dessutom inducerar överföring av CBir1 TCR transgena (Tg) T-celler intestinal inflammation i immunbrist möss6, som liknar den mänskliga IBD, vilket indikerar att denna T-cellöverföringsmodell hjälper till att undersöka mekanismerna hos mänsklig IBD.
Detta arbete beskriver det detaljerade protokollet för att inducera kolit i Rag1-/- möss genom adoptiv överföring av CBir1 TCR Tg nave CD4 + T celler och bedöma sjukdomen allvarlighetsgrad. Dessutom visas de förväntade resultaten, och de kritiska stegen i förfarandet och felsökningen diskuteras, vilket kommer att hjälpa forskare att undersöka mekanismerna för patogenes vid tarminflammation och testa de potentiella läkemedlen för behandling av IBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om varje steg är viktigt för reproducerbarheten av denna kolitmodell, finns det flera kritiska steg. Mottagaren Rag-/- möss bör få tillräckliga livskraftiga naϊve CD4 + T-celler för att inducera tarminflammation. Vi använde mjältar för isolering av naiva CD4 + T-celler istället för MLN. Eftersom utbytet av naiva CD4 + T-celler i MLN är mycket lägre än i mjältar. CD62L uttrycks starkt i naiva T-celler, och CD44 och CD25 är aktiveringsmarkörerna …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health grants DK125011, AI150210 och DK124132, University of Texas System STARs award (Y.C.) och James W. McLaughlin Fellowship Fund från University of Texas Medical Branch i Galveston (W.Y.). Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
Riferimenti
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. . Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells’ differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn’s disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. . Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn’s disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. . T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
