Den nuværende protokol beskriver en forbedret metode til at øge co-ekspressionen af PDX1 og NKX6.1 transkriptionsfaktorer i bugspytkirtlen forfædre afledt af humane pluripotente stamceller (hPSC’er) i plane monolag. Dette opnås ved at genopfylde den friske matrix, manipulere celletæthed og dissociere de endodermale celler.
Humane pluripotente stamceller (hPSC’er) er et glimrende værktøj til at studere tidlig udvikling af bugspytkirtlen og undersøge de genetiske bidragydere til diabetes. hPSC-afledte insulinudskillende celler kan genereres til celleterapi og sygdomsmodellering, dog med begrænset effektivitet og funktionelle egenskaber. hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, der er forstadier til betaceller og andre endokrine celler, når de to transkriptionsfaktorer PDX1 og NKX6.1 udtrykker hinanden, angiver stamfædrene til funktionelle, insulinudskillende betaceller både in vitro og in vivo. hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre anvendes i øjeblikket til celleterapi hos type 1-diabetespatienter som en del af kliniske forsøg. Imidlertid genererer de nuværende procedurer ikke en høj andel af NKX6.1- og bugspytkirtelforfædre, hvilket fører til co-generation af ikke-funktionelle endokrine celler og få glukoseresponsive, insulinudskillende celler. Dette arbejde udviklede således en forbedret protokol til generering af hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, der maksimerer co-ekspressionen af PDX1 og NKX6.1 i et 2D-monolag. Faktorer som celletæthed, tilgængelighed af frisk matrix og dissociation af hPSC-afledte endodermale celler moduleres, der forstærkede PDX1- og NKX6.1-niveauer i de genererede forfædre i bugspytkirtlen og minimeret forpligtelse til alternativ leverafstamning. Undersøgelsen fremhæver, at manipulation af cellens fysiske miljø under in vitro-differentiering kan påvirke afstamningsspecifikation og genekspression. Derfor letter den nuværende optimerede protokol den skalerbare generering af PDX1 og NKX6.1 co-ekspressive forfædre til celleterapi og sygdomsmodellering.
Diabetes er en kompleks metabolisk lidelse, der påvirker millioner af mennesker globalt. Tilskud af insulin betragtes som den eneste behandlingsmulighed for diabetes. Mere avancerede tilfælde behandles med betacelleudskiftningsterapi, opnået ved transplantation af enten hele kadaverbugspytkirtlen eller holme 1,2. Flere spørgsmål omgiver transplantationsterapi, såsom begrænsning med tilgængeligheden og kvaliteten af vævet, invasivitet af transplantationsprocedurer ud over det kontinuerlige behov for immunosuppressive midler. Dette nødvendiggør behovet for at opdage nye og alternative muligheder for betacelleudskiftningsterapi 2,3. Humane pluripotente stamceller (hPSC’er) er for nylig dukket op som et lovende værktøj til forståelse af humane bugspytkirtelbiologi og som en ikke-udtømmende og potentielt en mere personlig kilde til transplantationsterapi 4,5,6,7. hPSC’er, herunder humane embryonale stamceller (hESC’er) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC’er), har en høj selvfornyelseskapacitet og giver anledning til enhver vævstype i det menneskelige legeme. hESC’er stammer fra embryonets indre cellemasse, og hiPSC’er omprogrammeres fra enhver somatisk celle 4,8.
Rettede differentieringsprotokoller er optimeret til at generere betaceller i bugspytkirtlen fra hPSC’er, der sekventielt leder hPSC’er gennem udviklingsstadier i bugspytkirtlen invitro. Disse protokoller genererer hPSC-afledte øorganoider. Mens de i høj grad er forbedret til at øge andelen af betaceller i bugspytkirtlen deri, er effektiviteten af protokoller meget variabel. Det øges ikke til mere end ~ 40% af NKX6.1 + / INSULIN + eller C-PEPTID + celler 5,9,10,11,12,13. De genererede betaceller er imidlertid ikke helt identiske med de voksne humane betaceller med hensyn til deres transkriptionelle og metaboliske profiler og deres respons på glucose 4,5,14. De hPSC-afledte betaceller mangler genekspression af vigtige betacellemarkører som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 og KCNK3 sammenlignet med voksne mennesker øer5. Derudover har de hPSC-afledte betaceller formindsket calciumsignalering som reaktion på glukose. De er forurenet med de co-genererede polyhormonale celler, der ikke udskiller passende mængder insulin som reaktion på stigende glukoseniveauer5. På den anden side kunne hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre, som er ø-prækursorer, genereres mere effektivt in vitro sammenlignet med betaceller og, når de transplanteres in vivo, modnes til funktionelle, insulinudskillende betaceller15,16. Kliniske forsøg er i øjeblikket fokuseret på at demonstrere deres sikkerhed og effektivitet ved transplantation hos T1D-forsøgspersoner.
Især er ekspression af transkriptionsfaktorerne PDX1 (Pancreas og Duodenal Homeobox 1) og NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) inden for den samme pancreas stamcellecelle afgørende for engagement i en betacelleafstamning5. Pankreatiske forfædre, der ikke udtrykker NKX6.1, giver anledning til polyhormonelle endokrine celler eller ikke-funktionelle betaceller17,18. Derfor er en høj co-ekspression af PDX1 og NKX6.1 i bugspytkirtlens stamfaderstadium afgørende for i sidste ende at generere et stort antal funktionelle betaceller. Undersøgelser har vist, at en embryoid krop eller 3D-kultur forbedrer PDX1 og NKX6.1 i bugspytkirtelforfædre, hvor de differentierende celler aggregeres, varierende mellem 40% -80% af PDX1 + / NKX6.1 + population12,19. Sammenlignet med suspensionskulturer er 2D-differentieringskulturer imidlertid mere omkostningseffektive, gennemførlige og praktiske til anvendelse på flere cellelinjer5. Vi viste for nylig, at monolagsdifferentieringskulturer giver mere end op til 90% af PDX1+/NKX6.1+ co-ekspressive hPSC-afledte pancreasforfædre20,21,22. Den rapporterede metode gav en høj replikationskapacitet til de genererede bugspytkirtelforfædre og forhindrede alternative skæbnespecifikationer såsom leverafstamning21. Derfor demonstrerer denne protokol heri en yderst effektiv metode til differentiering af hPSC’er til beta-celleprækursorer i bugspytkirtlen, der co-udtrykker PDX1 og NKX6.1. Denne metode anvender teknikken til dissociering af hPSC-afledt endoderm og manipulation af celletætheden efterfulgt af en udvidet FGF- og retinoidsignalering samt pindsvinehæmning for at fremme PDX1 og NKX6.1 co-ekspression (figur 1). Denne metode kan lette en skalerbar generation af hPSC-afledte beta-celleprækursorer i bugspytkirtlen til transplantationsterapi og sygdomsmodellering.
Dette arbejde beskriver en forbedret protokol til generering af pancreasprogenitorer fra hPSC’er med en høj co-ekspression af PDX1 og NKX6.1. Dissociation og replating af den hPSC-afledte endoderm ved halv densitet på frisk matrix resulterede i højere PDX1 og NKX6.1 i hPSC-afledte bugspytkirtelforfædre.
Selvom vækstfaktorcocktailen for hvert trin ligner meget P1-ND 27, har det vist sig, at en mere udvidet fase 3-behandling, herunder FGF og retinoid signalering og BMP og pindsvinehæmning …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
Portable vacuum aspirator | |||
Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
Tween 20 | Sigma | P2287 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |