ट्रांसक्रिप्टोम स्तर पर मानव प्राथमिक Mesenteric धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और प्रोफाइलिंग
Summary
प्रोटोकॉल मानव मेसेन्टेरिक धमनी से एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और प्रोफाइलिंग का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए मानव धमनी को तैयार करने के लिए एक विधि प्रदान की जाती है। प्रोटिओमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, और कार्यात्मक assays अलग कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को किसी भी मध्यम या बड़े आकार की धमनी के लिए फिर से तैयार किया जा सकता है।
Abstract
एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) पर्यावरणीय संकेतों के लिए अपनी गतिशील प्रतिक्रिया के माध्यम से संवहनी और पूरे शरीर के कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। ईसी के ट्रांसक्रिप्टोम और एपिजीनोम को स्पष्ट करना विकास, स्वास्थ्य और बीमारी में उनकी भूमिकाओं को समझने के लिए सर्वोपरि है, लेकिन पृथक प्राथमिक कोशिकाओं की उपलब्धता में सीमित है। हाल की प्रौद्योगिकियों ने ईसी ट्रांसक्रिप्टोम और एपिजीनोम के उच्च-थ्रूपुट प्रोफाइलिंग को सक्षम किया है, जिससे पहले अज्ञात ईसी सेल उप-आबादी और विकासात्मक प्रक्षेपवक्रों की पहचान हो सकती है। जबकि ईसी संस्कृतियां ईसी फ़ंक्शन और शिथिलता की खोज में एक उपयोगी उपकरण हैं, संस्कृति की स्थिति और कई मार्ग बाहरी चर पेश कर सकते हैं जो मूल ईसी के गुणों को बदलते हैं, जिसमें आकृति विज्ञान, एपिजेनेटिक राज्य और जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम शामिल हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, वर्तमान पेपर अपने मूल राज्य पर कब्जा करने के उद्देश्य से दाता मेसेंटेरिक धमनियों से मानव प्राथमिक ईसी को अलग करने की एक विधि को प्रदर्शित करता है। अंतरंग परत में ईसी को विशेष एंजाइमों के उपयोग के साथ यांत्रिक और जैव रासायनिक रूप से अलग किया जाता है। परिणामी कोशिकाओं का उपयोग सीधे थोक आरएनए या एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए किया जा सकता है या संस्कृति के लिए मढ़वाया जा सकता है। इसके अलावा, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए मानव धमनी ऊतक की तैयारी के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटफ़ॉर्म के लिए, हालांकि यह विधि अन्य स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग तकनीकों के लिए भी उपयुक्त है। इस पद्धति को स्वास्थ्य या रोग राज्यों में विभिन्न प्रकार के दाताओं से एकत्र किए गए विभिन्न जहाजों पर लागू किया जा सकता है ताकि ईसी ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक विनियमन में अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सके, जो एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान का एक महत्वपूर्ण पहलू है।
Introduction
रक्त वाहिकाओं के लुमेन को अस्तर करना, एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) संवहनी टोन और ऊतक परफ्यूजन के महत्वपूर्ण नियामक हैं। ईसी बाह्य कोशिकीय वातावरण पर प्रतिक्रिया करने और रक्त प्रवाह की गतिशीलता और संरचना में परिवर्तन के अनुकूल होने की उनकी क्षमता में उल्लेखनीय हैं। इन गतिशील प्रतिक्रियाओं को इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के नेटवर्क के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है, जिसमें स्पैटिओ-टेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन शामिल हैं। इन प्रतिक्रियाओं की अव्यवस्था कई विकृतियों में फंस गई है, जिसमें हृदय रोग, मधुमेह और कैंसर 1,2 तक सीमित नहीं है।
अध्ययनों का एक बड़ा हिस्सा ईसी ट्रांसक्रिप्टोम से पूछताछ करने के लिए सेल लाइनों या पशु मॉडल का उपयोग करता है। पूर्व एक उपयोगी उपकरण है, उपयोग और सस्तीता की सापेक्ष आसानी को देखते हुए। हालांकि, सीरियल कल्चरिंग ईसी में फेनोटाइपिक परिवर्तन पेश कर सकती है, जैसे कि फाइब्रोब्लास्टिक विशेषताएं और ध्रुवीकरण की कमी, उन्हें विवो राज्य 3 से डिस्कनेक्ट कर सकतीहै। प्राथमिक कोशिकाएं, उदाहरण के लिए, मानव नाभि शिरा ईसी (एचयूवीईसी) 1980 के दशक के बाद से एक लोकप्रिय विकल्प रही हैं, लेकिन एक विकासात्मक संवहनी बिस्तर से व्युत्पन्न हैं जो वयस्कों में मौजूद नहीं है, इस प्रकार परिपक्व ईसी का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व करने की संभावना नहीं है। जानवरों, विशेष रूप से माउस मॉडल, बेहतर ECs के शारीरिक या pathophysiological वातावरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और आनुवंशिक गड़बड़ी के परिणामस्वरूप transcriptomes की पूछताछ की अनुमति देते हैं। मुरीन ईसी को विभिन्न ऊतकों से अलग किया जा सकता है, जिसमें एंजाइम-आधारित प्रक्रियाओं 4,5,6,7 का उपयोग करके महाधमनी, फेफड़े और वसा ऊतक शामिल हैं। हालांकि, अलग-थलग कोशिकाओं का उपयोग कई मार्गों के लिए नहीं किया जा सकता है जब तक कि6 परिवर्तित न हो और अक्सर संख्याओं में सीमित न हो, जिसके लिए कई जानवरोंसे पूलिंग की आवश्यकता होती है 5,8,9।
एक ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तर पर पोत वास्तुकला की खोज करने वाली नई प्रौद्योगिकियों के आगमन, विशेष रूप से एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ, उपन्यास कार्यों और ईसी 5,10,11,12,13,14 के गुणों का खुलासा करके एंडोथेलियल जीव विज्ञान के एक नए युग को सक्षम किया है। Tabula Muris जांचकर्ताओं द्वारा निर्मित एक समृद्ध संसाधन ने 100,000 कोशिकाओं के एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल एकत्र किए, जिसमें 20 अलग-अलग म्यूरीन अंगोंमें ईसी शामिल हैं, जिसमें आम ईसी मार्कर जीन और अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर दोनों का पता चला है, जिसमें अंतर-और इंट्रा-ऊतक अंतर 5,13 के साथ अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर शामिल हैं। फिर भी, जीनोम, एपिजीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम में माउस और मानव के बीच स्पष्ट अंतर हैं, विशेष रूप से गैर-कोडिंग क्षेत्रों में 16,17,18। ये उपर्युक्त कमियां स्वास्थ्य और बीमारी में अपने मूल राज्य में ईसी की एक वफादार प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए मानव नमूनों का उपयोग करके ईसी के विश्लेषण के महत्व पर जोर देती हैं।
अधिकांश ईसी अलगाव विधियां अलग-अलग समय के लिए प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन से पहले समरूपता, बारीक काटने और ऊतक को कम करने के माध्यम से शारीरिक पृथक्करण पर भरोसा करती हैं। एंजाइम और स्थितियां ऊतक प्रकारों के बीच भी काफी भिन्न होती हैं, ट्रिप्सिन से कोलेजेनेस तक, अकेले यासंयोजन में उपयोग किए जाते हैं 19,20,21। आगे एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन या शुद्धिकरण को अक्सर ईसी की शुद्धता बढ़ाने के लिए शामिल किया जाता है। आमतौर पर, ईसी झिल्ली मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी, उदाहरण के लिए, CD144 और CD31 को चुंबकीय मोतियों के लिए संयुग्मित किया जाता है और सेल निलंबन22,23 में जोड़ा जाता है। इस तरह की रणनीति को आम तौर पर कई मानव और माउस ऊतकों से ईसी अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें इस प्रोटोकॉल में पेश की गई तकनीकें भी शामिल हैं।
अपने मूल राज्य में, ईसी कई सेल प्रकारों के साथ बातचीत करते हैं और संवहनी niches में मौजूद हो सकते हैं जहां सेल निकटता कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि एकल-सेल और एकल-परमाणु आरएनए-अनुक्रमण (एससीआरएनए और एसएनआरएनए-सेक) अध्ययन ईसी विषमता का वर्णन करने में हाल की सफलताओं के लिए सर्वोपरि रहे हैं, पृथक्करण प्रक्रिया ऊतक संदर्भ और सेल-सेल संपर्क को बाधित करती है, जो ईसी जीव विज्ञान को समझने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। 2012 में विकसित और 202024 में वर्ष की विधि का नाम दिया गया, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग का उपयोग वैश्विक जीन अभिव्यक्ति को प्रोफ़ाइल करने के लिए किया गया है, जबकि मस्तिष्क25, ट्यूमर 26 और वसा ऊतक27 सहित विभिन्न ऊतकों में स्थानिक विशेषताओं को बनाए रखा गयाहै। प्रौद्योगिकियों को लक्षित किया जा सकता है, विशेष आरएनए अनुक्रमों के लिए विशिष्ट जांच का उपयोग करके आत्मीयता अभिकर्मकों या फ्लोरोसेंट टैग से जुड़ा हुआ है, इस प्रकार उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन28,29,30,31 पर चुनिंदा जीन का पता लगाया जा सकता है। उन्हें32,33 भी अनलक्षित किया जा सकता है, आमतौर पर आरएनए पर कब्जा करने के लिए स्थानिक रूप से बारकोडेड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग किया जाता है, जो बाद के सेक लाइब्रेरी की तैयारी के लिए सीडीएनए में परिवर्तित हो जाते हैं और इसलिए पूरे ऊतक जीन अभिव्यक्ति को एक निष्पक्ष तरीके से कम करने का लाभ होता है। हालांकि, स्थानिक संकल्प वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रौद्योगिकियों के साथ एक एकल सेलुलर स्तर पर प्राप्त नहीं किया जाता है। इसे scRNA-seq डेटा के साथ डेटा एकीकरण के साथ कुछ हद तक दूर किया जा सकता है, अंततः अपनी मूल स्थानिक जानकारी34 को बनाए रखते हुए एक जटिल ऊतक संदर्भ में एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम के मानचित्रण की अनुमति देता है।
इसमें, मानव बेहतर मेसेंटेरिक धमनी का उपयोग करके ईसी ट्रांसक्रिप्टोम को प्रोफ़ाइल करने के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है, एक परिधीय धमनी जिसका उपयोग वासोडिलेशन, संवहनी रीमॉडलिंग, ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन35,36,37 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। दो तकनीकों का वर्णन किया गया है: 1) एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण या बाद में इन विट्रो संस्कृति के लिए उपयुक्त यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन वाले रक्त वाहिकाओं के अंतरंग से ईसी को अलग और समृद्ध करने के लिए; 2) स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग के लिए धमनी वर्गों को तैयार करने के लिए (चित्रा 1)। इन दो तकनीकों को स्वतंत्र रूप से या पूरक रूप से प्रोफ़ाइल ईसी और उनके आसपास की कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस वर्कफ़्लो को किसी भी मध्यम या बड़ी धमनी पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत वर्कफ़्लो एकल-कोशिका और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ मानव धमनी के एक टुकड़े से ईसी को प्रोफ़ाइल करने के लिए तकनीकों के एक सेट का विवरण देता है। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम और सीमित कारक हैं…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (Z.B.C. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था; DP1DK126138 और DP1HD087990 (S.Z.); एक एला Fitzgerald फाउंडेशन अनुदान और एक Wanek परिवार परियोजना (Z.B.C.के लिए); और एक मानव सेल एटलस बीज नेटवर्क अनुदान (Z.B.C. और S.Z. के लिए)। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध में पुरस्कार संख्या P30CA033572 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित सिटी ऑफ होप में इंटीग्रेटिव जीनोमिक्स कोर में किए गए काम को शामिल किया गया था। लेखकों को मानव ऊतकों के अलगाव के लिए आशा के शहर में आइलेट प्रत्यारोपण टीम के डॉ इस्माइल अल-अब्दुल्ला और डॉ. Meirigeng क्यूई, एससीआरएनए-seq विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए आशा के शहर में डॉ Dongqiang युआन, और डॉ मार्क Halushka कार्डियोवस्कुलर पैथोलॉजी के प्रभाग में धन्यवाद करना चाहते हैं, जॉन्स हॉपकिन्स यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन संवहनी histology में अपनी अमूल्य अंतर्दृष्टि के लिए।
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
Riferimenti
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