Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

Summary

O protocolo descreve o isolamento, a cultura e o perfil das células endoteliais da artéria mesentérica humana. Além disso, é fornecido um método para preparar a artéria humana para transcrição espacial. Os ensaios proteômicos, transcriptomics e funcionais podem ser realizados em células isoladas. Este protocolo pode ser reaproveitado para qualquer artéria de médio ou grande porte.

Abstract

As células endoteliais (CE) são cruciais para a função vascular e do corpo inteiro através de sua resposta dinâmica às pistas ambientais. Elucidar o transcritor e o epigenome das CE é primordial para entender seus papéis no desenvolvimento, saúde e doença, mas é limitado na disponibilidade de células primárias isoladas. As tecnologias recentes permitiram o perfil de alto rendimento do transcritor e do epigenome ce, levando à identificação de subpopulações de células EC até então desconhecidas e trajetórias de desenvolvimento. Embora as culturas CE sejam uma ferramenta útil na exploração da função e disfunção da CE, as condições de cultura e múltiplas passagens podem introduzir variáveis externas que alteram as propriedades da CE nativa, incluindo morfologia, estado epigenético e programa de expressão genética. Para superar essa limitação, o presente artigo demonstra um método de isolar as CEs primárias humanas das artérias mesentéricas doadoras com o objetivo de capturar seu estado natal. Os CES na camada intimal são dissociados mecanicamente e bioquimicamente com o uso de enzimas particulares. As células resultantes podem ser usadas diretamente para RNA em massa ou sequenciamento de RNA de células únicas ou banhadas para cultura. Além disso, um fluxo de trabalho é descrito para a preparação do tecido arterial humano para transcrição espacial, especificamente para uma plataforma comercialmente disponível, embora este método também seja adequado para outras técnicas de perfil de transcriptome espacial. Essa metodologia pode ser aplicada a diferentes vasos coletados de uma variedade de doadores em estados de saúde ou doenças para obter insights sobre a regulação transcricional e epigenética da CE, um aspecto crucial da biologia celular endotelial.

Introduction

Forrando o lúmen dos vasos sanguíneos, as células endoteliais (CE) são reguladores cruciais do tom vascular e da perfusão tecidual. Os CES são notáveis em sua capacidade de reagir ao ambiente extracelular e adaptar-se às mudanças na dinâmica e composição do fluxo sanguíneo. Essas respostas dinâmicas são mediadas através de uma rede de eventos de sinalização intracelular, incluindo modulações transcricionais e pós-transcricionais com resolução spatio-temporal. A desregulação dessas respostas está implicada em muitas patologias, incluindo, mas não se limitando a doenças cardiovasculares, diabetes e câncer ^1,2.

Uma grande proporção de estudos faz uso de linhas celulares ou modelos animais para interrogar o transcriptome ce. A primeira é uma ferramenta útil, dada a relativa facilidade de uso e a barata. No entanto, a cultura serial pode introduzir alterações fenotípicas nas CE, como características fibroblásticas e falta de polarização, desconectando-as de seu estado in vivo ³. As células primárias, por exemplo, a veia umbilical humana EC (HUVEC) têm sido uma escolha popular desde a década de 1980, mas são derivadas de um leito vascular de desenvolvimento que não existe em adultos, portanto improvável de representar plenamente CEs maduros. Os animais, especialmente os modelos de camundongos, representam melhor o ambiente fisiológico ou fisioterápico das CE e permitem o interrogatório de transcritos como resultado da perturbação genética. As ECs de Murine podem ser isoladas de vários tecidos, incluindo os tecidos de aorta, pulmões e adiposos usando procedimentos baseados em enzimas 4,5,6,7. No entanto, as células isoladas não podem ser usadas para múltiplas passagens, a menos que transformadas⁶ e muitas vezes são limitadas em número, o que requer a junção de vários animais ^5,8,9.

O advento de novas tecnologias explorando a arquitetura de embarcações a nível transcriptômico, particularmente com resolução unicelular, possibilitou uma nova era de biologia endotelial ao revelar novas funções e propriedades das CE 5,10,11,12,13,14. Um rico recurso construído pelos investigadores de Tabula Muris coletou perfis transcriômicos unicelulares de 100.000 células, incluindo CEs em 20 diferentes órgãos murinos¹⁵, que revelaram genes de marcadores EC comuns e assinaturas transcriômicas únicas com diferenças interetos intra-tecidos ^5,13. No entanto, há diferenças claras entre camundongos e humanos no genoma, epigenome e transcriptome, especialmente nas regiões não codificadoras 16,17,18. Essas desvantagens supracitadas enfatizam a importância da análise das CES utilizando amostras humanas para obter um perfil fiel das CE em seu estado natal em saúde e doença.

A maioria dos métodos de isolamento da CE depende da dissociação física através da homogeneização, corte fino e picar o tecido antes da incubação com enzimas proteolíticas para tempos diferentes. As enzimas e condições também variam consideravelmente entre os tipos de tecido, da trippsina à colagem, utilizadas sozinhas ou em combinação 19,20,21. Mais enriquecimento ou purificação à base de anticorpos são frequentemente incluídos para aumentar a pureza das CE. Tipicamente, anticorpos contra marcadores de membrana CE, por exemplo, CD144 e CD31 são conjugados a contas magnéticas e adicionados à suspensão celular^22,23. Tal estratégia pode ser geralmente adaptada para o isolamento da CE a partir de múltiplos tecidos humanos e de camundongos, incluindo as técnicas introduzidas neste protocolo.

Em seu estado natal, as CE interagem com vários tipos de células e podem existir em nichos vasculares onde a proximidade celular é crucial para a função. Embora estudos de sequenciamento de RNA unicelular e uni nuclear (scRNA e snRNA-seq) tenham sido primordiais para os recentes avanços na descrição da heterogeneidade ce, o processo de dissociação interrompe o contexto tecidual e o contato celular, que também são importantes para entender a biologia da CE. Desenvolvido em 2012 e nomeado Método do Ano em 2020²⁴, o perfil de transcriptome espacial tem sido utilizado para traçar o perfil da expressão genética global, mantendo as características espaciais em vários tecidos, incluindo cérebro²⁵, tumor²⁶ e tecido adiposo²⁷. As tecnologias podem ser direcionadas, utilizando sondas especializadas específicas para sequências específicas de RNA ligadas a reagentes de afinidade ou tags fluorescentes, detectando genes selecionados na resolução subcelular 28,29,30,31. Eles também podem ser não^{alvos 32,33}, tipicamente usando oligonucleotídeos espacialmente barrados para capturar RNA, que juntos são convertidos em cDNA para posterior preparação da biblioteca seq e, portanto, tem a vantagem de deduzir a expressão genética de tecido inteiro de forma imparcial. No entanto, a resolução espacial não é atualmente alcançada em um único nível celular com tecnologias comercialmente disponíveis. Isso pode ser superado até certo ponto com a integração de dados com dados scRNA-seq, permitindo, em última análise, o mapeamento de transcriptome unicelular em um contexto complexo de tecido, mantendo suas informações espaciais originais³⁴.

Aqui, um fluxo de trabalho é descrito para traçar o perfil de transcriptome CE utilizando artéria mesentérica superior humana, uma artéria periférica que tem sido usada para estudar vasodilatação, remodelação vascular, estresse oxidativo e inflamação 35,36,37. Duas técnicas são descritas: 1) para isolar e enriquecer as CEs da intimação dos vasos sanguíneos que combinam dissociação mecânica e digestão enzimática adequada para sequenciamento de transcrição unicelular ou cultura in vitro subsequente; 2) preparar seções arteriais para o perfil do transcriptome espacial (Figura 1). Essas duas técnicas podem ser realizadas de forma independente ou complementar para traçar CEs e suas células circundantes. Além disso, este fluxo de trabalho pode ser adaptado para uso em qualquer artéria média ou grande.

Protocol

Estudos de tecido humano foram realizados em espécimes desidentídos obtidos do Centro de Recursos Celulares ilhotas do sul da Califórnia na Cidade da Esperança. Os consentimentos de pesquisa para o uso de tecidos humanos pós-morte foram obtidos dos parentes mais próximos dos doadores, e a aprovação ética para este estudo foi concedida pelo Conselho de Revisão Institucional da Cidade da Esperança (IRB nº 01046). 1. Dissociação física (tempo estimado: 1-2 h) <ol…

Representative Results

A análise de CEs da artéria mesentérica usando uma combinação de dissociação mecânica e enzimática ou criopreservação para uso em vários ensaios a jusante é retratada aqui (Figura 1). As CE podem ser perfiladas nas artérias mesentéricas usando as seguintes etapas: A) dissociação mecânica da intima juntamente com digestão de colagem às células culturais; B) geração de suspensão unicelular para scRNA-seq; ou C) seções transversais da artéria podem ser incorporadas em…

Discussion

O fluxo de trabalho apresentado detalha um conjunto de técnicas para traçar CEs de uma única peça de artéria humana com resolução unicelular e espacial. Existem várias etapas críticas e fatores limitantes no protocolo. Uma chave para o perfil do transcriptome é o frescor do tecido e da integridade do RNA. É importante manter os tecidos no gelo o máximo possível antes do processamento para minimizar a degradação do RNA. Normalmente, os tecidos pós-morte são processados entre 8-14 h após a hora da morte. …

Materials

1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184