Isolering och profilering av humana primära mesenteriska arteriella endotelceller på transkriptomnivå

Summary

Protokollet beskriver isolering, odling och profilering av endotelceller från mänsklig mesenterisk artär. Dessutom tillhandahålls en metod för att förbereda mänsklig artär för rumslig transkriptomik. Proteomik, transkriptomik och funktionella analyser kan utföras på isolerade celler. Detta protokoll kan återanvändas för alla medelstora eller stora artärer.

Abstract

Endotelceller (EK) är avgörande för vaskulär och helkroppsfunktion genom sitt dynamiska svar på miljösignaler. Att belysa ecs transkriptom och epigenom är av största vikt för att förstå deras roller i utveckling, hälsa och sjukdom, men är begränsad i tillgången på isolerade primära celler. Ny teknik har möjliggjort profilering med hög genomströmning av EG-transkriptom och epigenom, vilket har lett till identifiering av tidigare okända EG-cellsubpopulationer och utvecklingsbanor. Medan EG-kulturer är ett användbart verktyg för att utforska EG-funktion och dysfunktion, kan odlingsförhållandena och flera passager introducera externa variabler som förändrar egenskaperna hos infödd EC, inklusive morfologi, epigenetiskt tillstånd och genuttrycksprogram. För att övervinna denna begränsning visar föreliggande papper en metod för att isolera mänskliga primära EG från donatorns mesenteriska artärer som syftar till att fånga sitt hemland. ECs i intimalskiktet dissocieras mekaniskt och biokemiskt med användning av särskilda enzymer. De resulterande cellerna kan användas direkt för bulk-RNA eller encellig RNA-sekvensering eller pläteras för odling. Dessutom beskrivs ett arbetsflöde för framställning av mänsklig arteriell vävnad för rumslig transkriptomik, speciellt för en kommersiellt tillgänglig plattform, även om denna metod också är lämplig för andra rumsliga transkriptomprofileringstekniker. Denna metod kan tillämpas på olika kärl som samlats in från en mängd olika givare i hälso- eller sjukdomstillstånd för att få insikt i EG-transkriptionell och epigenetisk reglering, en central aspekt av endotelcellbiologi.

Introduction

Foder blodkärlens lumen, endotelceller (ECs) är avgörande regulatorer för vaskulär ton och vävnadsperfusion. ECs är anmärkningsvärda i sin förmåga att reagera på den extracellulära miljön och anpassa sig till förändringar i dynamiken och sammansättningen av blodflödet. Dessa dynamiska svar förmedlas genom ett nätverk av intracellulära signalhändelser, inklusive transkriptionella och posttranskriptionella moduleringar med spatio-temporal upplösning. Dysreguleringen av dessa svar är inblandad i många patologier, inklusive men inte begränsat till hjärt-kärlsjukdomar, diabetes och cancer ^1,2.

En stor del av studierna använder cellinjer eller djurmodeller för att förhöra EC-transkriptom. Den förstnämnda är ett användbart verktyg, med tanke på den relativa användarvänligheten och billigheten. Seriell odling kan emellertid införa fenotypiska förändringar i EG, såsom fibroblastiska egenskaper och brist på polarisering, vilket kopplar bort dem från deras in vivo-tillstånd ³. De primära cellerna, t.ex. human navelven EC (HUVEC) har varit ett populärt val sedan 1980-talet men härrör från en utvecklingsvaskulär säng som inte finns hos vuxna, vilket sannolikt inte helt representerar mogna EC. Djur, särskilt musmodeller, representerar bättre den fysiologiska eller patofysiologiska miljön hos EG och tillåter förhör av transkriptom som ett resultat av genetisk störning. Murina EG kan isoleras från olika vävnader, inklusive aorta, lungor och fettvävnader med hjälp av enzymbaserade förfaranden 4,5,6,7. De isolerade cellerna kan emellertid inte användas för flera passager om de inte transformeras⁶ och är ofta begränsade i antal, vilket kräver sammanslagning från flera djur ^5,8,9.

Tillkomsten av ny teknik som utforskar fartygsarkitekturen på transkriptomisk nivå, särskilt med encellsupplösning, har möjliggjort en ny era av endotelbiologi genom att avslöja nya funktioner och egenskaper hos EG 5,10,11,12,13,14. En rik resurs byggd av Tabula Muris-utredare samlade encellstranskriptomiska profiler av 100 000 celler inklusive EC över 20 olika murina organ¹⁵, vilket avslöjade både vanliga EC-markörgener och unika transkriptomiska signaturer med inter- och intravävnadsskillnader ^5,13. Ändå finns det tydliga skillnader mellan mus och människa i genom, epigenom och transkriptom, särskilt i de icke-kodande regionerna 16,17,18. Dessa ovannämnda nackdelar betonar vikten av analys av EG med hjälp av mänskliga prover för att få en trogen profil av EG i sitt hemland i hälsa och sjukdom.

De flesta EC-isoleringsmetoder är beroende av fysisk dissociation genom homogenisering, finskärning och malet vävnad före inkubation med proteolytiska enzymer under olika tider. Enzymerna och tillstånden varierar också avsevärt mellan vävnadstyper, från trypsin till kollagenas, som används ensamt eller i kombination 19,20,21. Ytterligare antikroppsbaserad anrikning eller rening ingår ofta för att öka renheten hos EK. Typiskt är antikroppar mot EC-membranmarkörer, t.ex. CD144 och CD31 konjugerade till magnetiska pärlor och läggs till cellsuspensionen^22,23. En sådan strategi kan i allmänhet anpassas för EG-isolering från flera mänskliga vävnader och musvävnader, inklusive de tekniker som införs i detta protokoll.

I sitt ursprungliga tillstånd interagerar ECs med flera celltyper och kan existera i vaskulära nischer där cellnärhet är avgörande för funktion. Medan encells- och enkärniga RNA-sekvenseringsstudier (scRNA och snRNA-seq) har varit avgörande för de senaste genombrotten för att beskriva EG-heterogenitet, stör dissociationsprocessen vävnadskontext och cell-cellkontakt, vilket också är viktigt för att förstå EG-biologi. Utvecklad 2012 och utsedd till Årets metod 2020²⁴, har rumslig transkriptomprofilering använts för att profilera globalt genuttryck samtidigt som de rumsliga egenskaperna i olika vävnader bibehålls, inklusive hjärna²⁵, tumör²⁶ och fettvävnad²⁷. Teknikerna kan riktas med hjälp av specialiserade sonder som är specifika för specifika RNA-sekvenser fästa vid affinitetsreagens eller fluorescerande taggar, vilket detekterar utvalda gener vid subcellulär upplösning 28,29,30,31. De kan också vara oriktade^32,33, vanligtvis med hjälp av rumsligt streckkodade oligonukleotider för att fånga RNA, som tillsammans omvandlas till cDNA för efterföljande seq-biblioteksberedning och därmed har fördelen att härleda hela vävnadsgenuttryck på ett opartiskt sätt. Rumslig upplösning uppnås dock för närvarande inte på en enda cellulär nivå med kommersiellt tillgänglig teknik. Detta kan övervinnas till viss del med dataintegration med scRNA-seq-data, vilket i slutändan möjliggör kartläggning av encellstranskriptom i ett komplext vävnadssammanhang samtidigt som den behåller sin ursprungliga rumsliga information³⁴.

Här beskrivs ett arbetsflöde för att profilera EC-transkriptom med hjälp av mänsklig överlägsen mesenterisk artär, en perifer artär som har använts för att studera vasodilatation, vaskulär ombyggnad, oxidativ stress och inflammation 35,36,37. Två tekniker beskrivs: 1) att isolera och berika EK från intima blodkärl som kombinerar mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning som är lämplig för encellstranskriptomsekvensering eller efterföljande in vitro-odling; 2) att förbereda arteriella sektioner för rumslig transkriptomprofilering (Figur 1). Dessa två tekniker kan utföras oberoende eller komplementärt för att profilera ECs och deras omgivande celler. Dessutom kan detta arbetsflöde anpassas för användning på alla medelstora eller stora artärer.

Protocol

Mänskliga vävnadsstudier utfördes på avidentifierade prover erhållna från Southern California Islet Cell Resource Center vid City of Hope. Forskningsmedgivandena för användning av postmortem mänskliga vävnader erhölls från givarnas anhöriga, och etiskt godkännande för denna studie beviljades av Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr 01046). 1. Fysisk dissociation (beräknad tid: 1-2 timmar) Placera en ny artär på en 10 cm disk och tvätta…

Representative Results

Analysen av EG från mesenterisk artär med användning av en kombination av mekanisk och enzymatisk dissociation eller kryokonservering för användning i olika nedströms analyser visas här (Figur 1). ECs kan profileras i mesenteriska artärer med hjälp av följande steg: A) mekanisk dissociation från intima i kombination med kollagenas matsmältning till odlingsceller; B) generering av encellssuspension för scRNA-seq; eller C) tvärsnitt av artären kan bäddas in i OCT för att kryos…

Discussion

Det presenterade arbetsflödet beskriver en uppsättning tekniker för att profilera EG från en enda bit av mänsklig artär med encellig och rumslig upplösning. Det finns flera kritiska steg och begränsande faktorer i protokollet. En nyckel till transkriptomprofilering är vävnadens färskhet och RNA-integritet. Det är viktigt att hålla vävnader på is så mycket som möjligt före bearbetning för att minimera RNA-nedbrytning. Vanligtvis behandlas post-mortemvävnaderna mellan 8-14 timmar efter dödstiden. Att p…

Materials

1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184