Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale
Summary
Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.
Abstract
La stima del livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica poiché l’ingresso del calcio nella cellula presinaptica innesca una cascata di eventi che portano al rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di calcio presinaptico mediano l’attività di molte proteine intracellulari e svolgono un ruolo importante nella plasticità sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. La giunzione neuromuscolare è un modello adatto per studiare la plasticità sinaptica, in quanto ha un solo tipo di neurotrasmettitore. Questo articolo descrive il metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il fascio nervoso tagliato nelle terminazioni nervose motorie dei topi. Questo metodo consente la stima di tutti i parametri relativi alle variazioni intracellulari del calcio, come il livello basale di calcio e il calcio transitorio. Poiché l’afflusso di calcio dall’esterno cellulare nelle terminazioni nervose e il suo legame / slegamento al colorante sensibile al calcio avvengono nell’intervallo di pochi millisecondi, è necessario un sistema di imaging veloce per registrare questi eventi. In effetti, le telecamere ad alta velocità sono comunemente utilizzate per la registrazione di cambiamenti rapidi del calcio, ma hanno bassi parametri di risoluzione dell’immagine. Il protocollo qui presentato per la registrazione dei transitori di calcio consente una risoluzione spazio-temporale estremamente buona fornita dalla microscopia confocale.
Introduction
Il problema di misurare le onde veloci di calcio nelle cellule eccitabili è uno degli aspetti più importanti e impegnativi dello studio della trasmissione del segnale nel sistema nervoso centrale e periferico. Gli ioni calcio svolgono un ruolo importante nell’innescare il rilascio di neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la modulazione dell’attività di varie proteine intracellulari 1,2,3,4,5. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative6. Per misurare i cambiamenti nei livelli di calcio, i coloranti fluorescenti sensibili al calcio sono comunemente usati e i cambiamenti nel loro livello di fluorescenza sono analizzati 7,8,9.
Il caricamento di coloranti di calcio nelle cellule può essere ottenuto in diversi modi. Principalmente, i coloranti cellula-permeant sono usati10,11. Tuttavia, in tal caso, non è solo difficile controllare la concentrazione di un colorante all’interno della cellula, ma è anche difficile selezionare le cellule bersaglio per il caricamento. Questo metodo non è applicabile per lo studio delle terminazioni nervose periferiche poiché il colorante entra nelle cellule postsinaptiche. Invece, i coloranti impermeant cellulari sono più adatti per tali preparazioni. In questo caso, i coloranti vengono consegnati alle cellule mediante microiniezione o attraverso una pipetta patch12,13,14. C’è anche un metodo di caricamento attraverso un moncone nervoso. Quest’ultimo metodo è più adatto per le preparazioni della giunzione neuromuscolare 15,16,17,18,19,20. Permette di eseguire la colorazione solo per le cellule di interesse. Sebbene questo metodo non fornisca una valutazione accurata della concentrazione del colorante nella cellula bersaglio, la concentrazione può essere stimata approssimativamente confrontando il livello di fluorescenza delle cellule a riposo in soluzioni con una concentrazione nota di calcio21. In questo studio, viene presentata una modifica di questo metodo applicato alle sinapsi dei mammiferi.
L’ingresso di calcio durante la fase depolarizzante del potenziale d’azione è un processo veloce, specialmente nella giunzione neuromuscolare; Pertanto, per la sua registrazione, è necessaria un’attrezzatura appropriata1. Un recente studio che utilizza un colorante fluorescente sensibile alla tensione ha dimostrato che la durata del potenziale d’azione nella sinapsi periferica di un topo è di circa 300 μs22. Il calcio transitorio, valutato utilizzando coloranti calcio-sensibili nelle sinapsi periferiche della rana, ha una durata maggiore: il tempo di salita è di circa 2-6 ms e il tempo di decadimento è di circa 30-90 ms, a seconda del colorante di calcio utilizzato23,24. Per misurare processi veloci con l’aiuto di coloranti fluorescenti, vengono generalmente utilizzate telecamere CCD o CMOS, con matrici CCD veloci e sensibili. Tuttavia, queste telecamere hanno lo svantaggio della bassa risoluzione, limitata dalla dimensione degli elementi sensibili della matrice25,26,27,28. Le telecamere più veloci con sensibilità sufficiente per registrare sia i potenziali d’azione che i transitori di calcio in risposta alla stimolazione a bassa frequenza delle cellule hanno una frequenza di scansione di 2.000 Hz e una matrice con una dimensione di 80 x 8029. Per ottenere segnali con una risoluzione spaziale più elevata, viene utilizzata la microscopia confocale, soprattutto se è necessario valutare alcune variazioni volumetriche nel segnale30,31,32. Ma va tenuto presente che la microscopia confocale ha un’alta velocità di scansione in modalità di scansione lineare, ma ci sono ancora limitazioni significative sulla velocità delle registrazioni di processi veloci quando si costruisce un’immagine spaziale33. Esistono microscopi confocali basati su dischi Nipkow rotanti (microscopia a scansione a fessura) e scanner multipoint-array, che hanno una maggiore velocità di scansione. Allo stesso tempo, sono inferiori ai microscopi confocali classici nel filtraggio delle immagini confocali (diafonia forica per microscopi con un disco di Nipkow)32,34,35. L’imaging confocale con scansione a risonanza può anche fornire un’elevata risoluzione spazio-temporale richiesta per misurazioni temporali elevate36. Tuttavia, tenere conto del fatto che la registrazione di risposte fluorescenti deboli ad alta velocità di scansione quando si utilizzano scanner a risonanza richiede rivelatori altamente sensibili come i rilevatori ibridi36.
Questo articolo presenta un metodo per aumentare la risoluzione temporale dei segnali registrati con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) mantenendo la risoluzione spaziale37. Il metodo attuale è un ulteriore sviluppo dei metodi descritti in precedenza e trasferiti alla piattaforma LSCM38,39,40. Questo approccio non richiede modifiche nell’hardware del microscopio e si basa sull’applicazione di un algoritmo per la registrazione di segnali fluorescenti periodicamente evocati con uno spostamento temporale rispetto al momento della stimolazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo per caricare il colorante sensibile al Ca2+ nelle terminazioni nervose del topo attraverso il moncone nervoso e per registrare un transitorio di calcio veloce utilizzando un microscopio confocale è presentato in questo articolo. Come risultato dell’implementazione di questo metodo di carico, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza per consentire la registrazione dell’ingresso di calcio nelle terminazioni nervose in risposta alla s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli studi sulla fluorescenza di questo lavoro sono stati condotti con il sostegno finanziario della Russian Science Foundation Grant (progetto n. 19-15-00329). Il metodo è stato sviluppato sotto finanziamento dell’incarico governativo per FRC Kazan Scientific Center di RAS АААА-А18-118022790083-9. La ricerca è stata sviluppata con l’uso delle attrezzature del Centro di ricerca federale “Kazan Scientific Center of RAS”. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Victor I. Ilyin per la lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Flow regulator | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | Disposable infusion set with Flow regulator |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Illumination system Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germany | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Las X software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Magnetic Holder with Suction Tubing | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latvia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latvia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt | Molecular Probes, USA | O6806 | 500 μg |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10 µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10 µL |
| Plasticine | local producer | ||
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40 mm |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems , Germany | ||
| Suction electrode | Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. – No. 9 (40) Part 3. – P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning, USA | ||
| Syringe | local producer | 0.5 mL | |
| Syringe | local producer | 60 mL |
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