JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

Published: February 09, 2022
doi:
10.3791/63311
, ,
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI),Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences,Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.

Abstract

유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 최근 발전으로 지방세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 생성이 가능해졌습니다. 그러나, 현재의 분화 방법은 효율이 낮고, 지방세포의 균질한 집단을 생성하지 않는다. 여기에서 우리는 높은 수율로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 생산하기 위해 all-trans retinoic 기반 방법을 사용하여 이 문제를 우회합니다. 세포 증식, 생존 및 부착을 제어하는 경로를 조절함으로써 당사의 분화 전략은 다능성 중간엽의 순수한 집단으로 분화하는 배아체(EB)의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 방법에 의해 생성된 많은 수의 중간엽 줄기세포는 지방세포를 생성하기 위한 이상적인 공급원을 제공합니다. 그러나 지방 세포 분화로 인한 샘플 이질성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 따라서 우리는 FACS를 사용하여 지질 함유 성숙 지방 세포를 정제하기 위해 Nile red 기반 방법을 사용했습니다. 이 분류 전략을 통해 샘플 이질성이 감소하고 세포 기능이 향상된 지방 세포 풀을 사용하여 지방 세포 관련 대사 장애를 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립할 수 있었습니다.

Introduction

중간엽 줄기 세포(MSC)는 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포와 같은 중배엽 기원 세포를 생산하기 위한 효과적인 일시적 자원 역할을 하며, 이는 각각의 유전 질환을 모델링하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 그러나, 이전의 접근법은 성인 조직으로부터 이러한 중간엽 줄기세포를 얻는 것에 의존했다1, 이는 기증자로부터 많은 수의 중간엽 줄기세포를 얻는 데 어려움을 겪었고, 차선의 체외 배양 조건1,2에서 기능적으로 생존할 수 있도록 유지하는 데 한계가 있었다. 이러한 장애물은 시험관 내에서 MSC를 생성하기 위한 프로토콜을 갖는 것에 대한 큰 수요를 낳았습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 MSC 특성 3,4,5를 나타내는 MSC의 귀중한 공급원으로 사용될 수 있습니다. iPSC 유래 중간엽 줄기세포는 여러 질병에서 치료 옵션으로 사용할 수 있습니다. 또한 iPSC 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포를 생성하는 능력은 인간 지방생성, 비만 및 지방세포 관련 장애를 연구하는 데 유용한 시험관 내 인간 모델이 됩니다.

지방세포의 현재 분화 프로토콜은 두 그룹으로 분류할 수 있는데, 하나는 화학적 또는 단백질 기반 칵테일을 사용하여 지방세포를 분화하여 30%-60%6,7,8,9의 결과 수율을 제공하는 반면, 다른 하나는 80%-90%10의 수율을 제공하기 위해 지방세포 발달을 지배하는 주요 전사 인자의 강력한 유도를 위한 유전자 조작을 포함합니다. 11. 그러나 유전자 조작은 지방세포 분화의 자연적 과정을 요약하지 않으며, 종종 지방 생성 중에 도달하는 미묘한 패러다임을 가려서 질병 모델링 목적에는 효과적이지 않습니다12,13. 따라서 우리는 나일 레드를 사용하여 지질 함유 지방 세포를 형광으로 태그하여 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 미성숙 지방세포에서 분류하는 방법을 제시합니다.

여기에서 우리는 지방 세포 생성에 추가로 사용될 수 있는 많은 수의 빠르게 증식하는 중간엽을 생성하기 위해 iPSC 유래 배아체(EB)를 all-trans retinoic acid와 함께 일시적으로 배양하는 프로토콜을 제시합니다14. 우리는 또한 친유성 염료를 사용하여 지질 방울에 형광 태그를 지정하여 이질적인 분화 풀에서 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 나일 레드. 이를 통해 지방 세포 관련 대사 장애를 정확하게 모델링할 수 있는 향상된 기능을 가진 성숙한 지방 세포의 순수한 집단을 생성할 수 있습니다.

Protocol

이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC(No. 16260/16) 및 QBRI(No. 2016-003)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1 및 H9와 같은 hESC에도 최적화되어 있습니다. 충분한 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액 샘플을 채취했습니?…

Representative Results

중간엽 분화 중 세포의 도식 및 형태: iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화하려면 EB 형성, 중간엽 분화 및 MSC 확장에 걸친 다양한 발달 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 발달 단계에서 세포는 다양한 자극 화학 물질로 인해 다양한 형태를 얻습니다. 분화가 시작되면 세포는 현탁액에 도말되며 직경이 작거나 중간 크기인 동안 정의된 세포 경계와 함께 둥글게 될 것으로 예상됩니?…

Discussion

이 프로토콜은 MSC에 높은 수율과 효율성을 제공할 수 있는 능력으로 인해 가장 중요합니다. 중간엽 줄기세포의 이러한 대량 생산은 10μM의 RA14,15를 사용한 iPSC 유래 EB의 일시적인 배양에 의해 가능했습니다. 10μM의 RA를 사용한 일시적인 처리는 MSC 수율을 11.2배에서 1542배까지14,15배 향상시켰으며, 이 프로토콜?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호 NPRP10-1221-160041)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 마리암 아가디는 카타르 국립 연구 기금(QNRF)의 GSRA 장학금을 지원받았습니다.

Materials

Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Tags

Human IPSCsAdipocyte DifferentiationMesenchymal Stem CellsNile Red SortingMSC Differentiation MediaRetinoic AcidEmbryonic BodiesDMEM Low-glucose Medium
check_url/it/63311?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image