نظام فسيولوجي دقيق لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض أثناء الالتهاب
Summary
في هذا البروتوكول ، يتم استخدام فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج بيئة الأوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بأكملها ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض في الأمراض الالتهابية.
Abstract
تلعب تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض دورا مهما في الأمراض الالتهابية مثل الإنتان. أثناء الالتهاب، يمكن أن تؤدي الهجرة المفرطة لكريات الدم البيضاء المنشطة عبر بطانة الأوعية الدموية إلى الأعضاء الرئيسية إلى فشل الأعضاء. تم تطوير والتحقق من صحة فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (bMFA) باستخدام العديد من التقنيات التجريبية والحسابية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج سلسلة الكريات البيض المتداول / الالتصاق / الهجرة بأكملها لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكريات البيض. تم رقمنة شبكات الأوعية الدموية الدقيقة التي تم الحصول عليها من الصور الموجودة في الجسم الحي في القوارض باستخدام نهج نظام المعلومات الجغرافية (GIS) وتم تصنيعها بدقة مع polydimethylsiloxane (PDMS) على شريحة مجهرية. لدراسة تأثير معدل القص وطوبولوجيا الأوعية الدموية على تفاعلات الخلايا البطانية لكريات الدم البيضاء، تم تطوير نموذج ديناميات الموائع الحسابية (CFD) لإنشاء خريطة مقابلة لمعدلات القص والسرعات في جميع أنحاء الشبكة. يتيح bMFA التحديد الكمي لتفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض ، بما في ذلك سرعة الدوران ، وعدد الكريات البيض الملتصقة استجابة لمعدلات القص المختلفة ، وعدد الكريات البيض المهاجرة ، ونفاذية الخلايا البطانية ، والتعبير عن جزيء الالتصاق وغيرها من المتغيرات الهامة. علاوة على ذلك ، باستخدام العينات المتعلقة بالإنسان ، مثل الخلايا البطانية البشرية والكريات البيض ، يوفر bMFA أداة للفحص السريع للعلاجات المحتملة لزيادة قابليتها للترجمة السريرية.
Introduction
الالتهاب هو استجابة المضيف للعدوى والإصابة ، وتلعب البطانة دورا مهما في الاستجابة الالتهابية1،2،3. خلل التنظيم الالتهابي هو السبب الكامن وراء عدد من أمراض الأمراض مثل الإنتان وأمراض القلب والأوعية الدموية والربو وأمراض الأمعاء الالتهابية والسرطان و COVID-19. تلعب تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض دورا مركزيا في هذه الأمراض الالتهابية. أثناء الالتهاب ، يؤدي إطلاق PAMPS (الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض) من مسببات الأمراض أو DAMPS (الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر) من الأنسجة المصابة إلى تنشيط الخلايا المناعية لإطلاق السيتوكينات / الكيموكينات وغيرها من الوسطاء المؤيدين للالتهابات التي تؤدي إلى تنشيط البطانة ، مما يؤدي إلى تغييرات في وظيفة حاجز بطانة الأوعية الدموية وزيادة النفاذية 3,4 . يؤدي زيادة تنشيط الخلايا البطانية أثناء الالتهاب إلى تعزيز تفاعل الخلايا البيضاء مع الخلايا البطانية مما يؤدي إلى الهجرة المفرطة لكريات الدم البيضاء المنشطة عبر بطانة الأوعية الدموية إلى الأعضاء الرئيسية1،5،6،7.
يبدأ تجنيد الكريات البيض بواسطة جاذبات كيميائية متنوعة كيميائيا تتكون من الدهون النشطة بيولوجيا والسيتوكينات والكيموكينات والمكونات المكملة 8,9. تجنيد الكريات البيض هو عملية متعددة الخطوات تتضمن خمس خطوات منفصلة: 1) هامش الكريات البيض والتقاطها / تعلقها ، 2) المتداول ، 3) الاعتقال الثابت ، 4) الانتشار والزحف و 5) الإسراف / الهجرة (الشكل 1). كل خطوة من هذه العملية تتطلب الحديث المتبادل بين الكريات البيض والخلايا البطانية لتنسيق هذه الظاهرة الديناميكية 1,9. في نهاية المطاف، تنتشر الكريات البيض الموقوفة في الأنسجة الملتهبة عبر البطانة عبر عملية متعددة الخطوات يتم التحكم فيها بواسطة إشارات متزامنة تعتمد على الجاذب الكيميائي والأحداث اللاصقة وقوى القص الديناميكية الدموية 1،9،10،11،12.
بالنظر إلى الدور المركزي لإجهاد القص في تنظيم وظيفة الخلايا البطانية وأهمية تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض13 ، تم تطوير العديد من النماذج في المختبر خلال العقود القليلة الماضية لدراسة جوانب مختلفة من سلسلة هجرة الكريات البيض في بيئة أكثر تحكما14. يمكن تصنيف الأجهزة الموائعة التقليدية لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض إلى فئتين عريضتين14: أ) أجهزة لدراسة دوران الكريات البيض والالتصاق والتعبير عن جزيء الالتصاق مثل غرف تدفق الصفائح المتوازية و ب) أجهزة لدراسة هجرة الكريات البيض في ظل ظروف ثابتة مثل غرف البئر. تم استخدام أنظمة مثل غرف تدفق الصفائح المتوازية لدراسة أدوار جزيئات الالتصاق وأربطتها في شلال الالتصاق تحت قوى القص15. ومع ذلك ، فإن العيب الكبير هو أن هذه الأجهزة المبسطة والمثالية (على سبيل المثال ، القناة المستقيمة) غير قادرة على إعادة إنتاج حجم وهندسة الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي (على سبيل المثال ، تشعبات الأوعية الدموية المتتالية ، مورفولوجيا الأوعية الدموية) وظروف التدفق الناتجة (على سبيل المثال ، التدفقات المتقاربة أو المتباينة عند التشعبات). ونتيجة لذلك ، يمكن لهذه الأجهزة فقط نموذج الالتصاق ولكن ليس الهجرة. يمكن لغرف ترانسويل فقط دراسة الهجرة العابرة في ظل ظروف ثابتة دون النظر في الميزات الهندسية في الجسم الحي وظروف التدفق. وبالتالي ، فإن هذه النماذج التقليدية لا تحاكي البيئة الدقيقة للأنسجة الحية أو تحل التصاق والهجرة في فحص واحد6.
لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير والتحقق من صحة فحص الموائع الدقيقة ثلاثي الأبعاد ثلاثي الأبعاد (bMFA) (الشكل 2) ، والذي يتكاثر بشكل واقعي في شبكات الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي على شريحة16،17،18. تم نشر بروتوكول التصنيع الدقيق لهذا الجهاز سابقا17 ويتم وصفه بإيجاز فقط هنا. تمت رقمنة الأوعية الدموية الدقيقة لعضلة كريماستر الفأر باستخدام نهج معدل لنظام المعلومات الجغرافية (GIS)19. بعد ذلك ، تم إنشاء شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية على polydimethylsiloxane (PDMS) باستخدام عمليات الطباعة الحجرية الناعمة على أساس شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الرقمية14،17،20،21،22. باختصار ، تمت طباعة صور الشبكة الرقمية على فيلم Mylar ، والذي تم استخدامه بعد ذلك كقناع لتصميم مقاومة ضوئية إيجابية SU-8 فوق رقاقة سيليكون لإنشاء سادة للتصنيع. تم استخدام أعمدة دقيقة الصنع (قطرها 10 ميكرومتر ، طولها 3 ميكرومتر) لإنشاء مسام بارتفاع 3 ميكرومتر وعرض 100 ميكرومتر ، وهو الحجم الأمثل لهجرة الكريات البيض23،24،25 ، التي تربط القنوات الوعائية ومقصورات الأنسجة. تم إعداد PDMS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وسكب على الأساتذة المتقدمين. علاوة على ذلك ، تم تفريغ PDMS وسمح له بالعلاج بين عشية وضحاها في فرن (65 درجة مئوية) لإنشاء قنوات دقيقة تكميلية في PDMS. في وقت لاحق ، تم تقشير PDMS المعالج من سيد SU-8 ، متبوعا بمنافذ اللكم للمداخل / المنافذ. ثم ، تم ربط PMDS بالبلازما بشريحة زجاجية. يتكون سطح جهاز الموائع الدقيقة من الزجاج الأصلي و PDMS. من أجل تعزيز تعلق الخلايا وانتشارها وانتشارها ، يلزم طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM). يتضمن bMFA شبكة الأوعية الدموية الدقيقة وحجرة الأنسجة المتصلة عبر مسام بارتفاع 3 ميكرومتر وعرض 100 ميكرومتر (الشكل 2). يقوم نظام الموائع الدقيقة هذا بإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بالكامل في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجيا لشبكة الأوعية الدموية الدقيقة الكاملة مع الأوعية المترابطة والتشعبات ، بما في ذلك الدورة الدموية والهوامش والدحرجة والالتصاق وهجرة الكريات البيض إلى حجرة الأنسجة خارج الأوعية الدموية في نظام واحد14،16،17،21،26.
تجدر الإشارة إلى أنه حتى عندما يكون معدل التدفق عند مدخل bMFA ثابتا ، فإن ظروف التدفق في الشبكة تختلف في مواقع مختلفة ولا يمكن حسابها بصيغة رياضية بسيطة. تم تطوير نموذج قائم على ديناميكيات الموائع الحسابية (CFD) لحساب معلمات التدفق المختلفة (على سبيل المثال ، إجهاد القص ، معدل القص ، السرعة) في مواقع مختلفة في الشبكة. تم استخدام نموذج CFD هذا لمحاكاة أنماط تروية الصبغة ومعلمات التدفق في bMFA. ويشير التحقق المتبادل مع النتائج التجريبية إلى أن مقاومة التدفق عبر الشبكة يمكن التنبؤ بها بشكل جيد من خلال النموذج الحسابي (الشكل 3)17. ثم تم استخدام نموذج CFD هذا لتقدير السرعة وملف تعريف معدل القص في كل وعاء من bMFA (الشكل 4) ، مما يسمح بتحليل آثار تدفق القص والهندسة على تدحرج الكريات البيض والالتصاق والهجرة16. تلتصق الكريات البيض بشكل تفضيلي بالقرب من التشعبات وفي مناطق القص المنخفضة في الجسم الحي ، وقد أثبتت هذه الأنماط المكانية من التصاق الكريات البيض بنجاح في bMFA باستخدام العدلات (الشكل 5)16. تصف هذه الورقة بروتوكول إعداد bMFA لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض في ظل الظروف الالتهابية باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية (HLMVEC) والعدلات البشرية. يمكن استخدام الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة ، مثل bMFA ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية مع أنواع مختلفة من الخلايا مثل العدلات والخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية والخلايا السرطانية18،27،28،29،30. يمكن زرع bMFA مع الخلايا البطانية الأولية من أعضاء مختلفة (على سبيل المثال ، الرئة مقابل الدماغ) وأنواع مختلفة (على سبيل المثال ، الخلايا البطانية البشرية مقابل الفئران) ، وكذلك خطوط الخلايا البطانية 21،27،31،32. يمكن استخدام bMFA لدراسة الاستجابات الخلوية المتعددة ، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية ، ووظيفة الحاجز ، وتوصيل الدواء وسمية الدواء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستنسخ bMFA التضاريس وظروف التدفق لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي ويمكن استخدامه لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض والوظيفة البطانية في المختبر في ظل ظروف واقعية من الناحية الفسيولوجية. في الأوعية الدموية الدقيقة للفأر أو الإنسان ، تكون هندسة شبكات الأوع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، رقم المنحة: GM114359 و GM134701 (M.F.K. و L.E.K.) ، 1F31AI164870-01 (J.C.L.) ، ووكالة الحد من التهديدات الدفاعية ، رقم المنحة: HDTRA11910012 (M.F.K. و L.E.K.).
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
