מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת
Summary
בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.
Abstract
אינטראקציות תאי לויקוציט-אנדותל ממלאות תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כגון אלח דם. במהלך דלקת, הגירה מופרזת של לויקוציטים מופעלים על פני אנדותל כלי הדם לאיברים מרכזיים יכול להוביל לכשל איברים. בדיקה מיקרופלואידית ביומימטית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (bMFA) פותחה ואומתה באמצעות מספר טכניקות ניסיוניות וחישוביות, שיכולות לשחזר את כל מפל הגלגול/הידבקות/הגירה של לויקוציטים כדי ללמוד אינטראקציות בין תאי לויקוציט אנדותל. רשתות מיקרו-וסקולריות שהושגו מתמונות in vivo במכרסמים עברו דיגיטציה באמצעות גישה של מערכת מידע גיאוגרפית (GIS) ומיקרו-פבריקט עם פולידימתילסילסילוקסן (PDMS) בשקופית מיקרוסקופ. כדי לחקור את ההשפעה של קצב הגזירה וטופולוגיית כלי הדם על אינטראקציות תאים לויקוציטים-אנדותל, פותח מודל דינמיקה של נוזל חישובי (CFD) כדי ליצור מפה מקבילה של קצבי הטיה ומהירויות ברחבי הרשת. bMFA מאפשר כימות של אינטראקציות תאי לויקוציטים אנדותל, כולל מהירות מתגלגלת, מספר לויקוציטים דבוקים בתגובה לשיעורי הטיה שונים, מספר לויקוציטים נודדים, חדירות תאי אנדותל, ביטוי מולקולת הידבקות ומשתנים חשובים אחרים. יתר על כן, על ידי שימוש בדגימות הקשורות לבני אדם, כגון תאי אנדותל אנושיים ולויקוציטים, bMFA מספקת כלי להקרנה מהירה של טיפולים פוטנציאליים כדי להגדיל את יכולת התרגום הקליני שלהם.
Introduction
דלקת היא התגובה המארחת לזיהום ופציעה, והאנדותל ממלא תפקיד חשוב בתגובה הדלקתית 1,2,3. דיסרגציה דלקתית היא הגורם הבסיסי למספר פתולוגיות מחלות כגון אלח דם, מחלות לב וכלי דם, אסתמה, מחלות מעי דלקתיות, סרטן ו- COVID-19. אינטראקציות בין תאי לויקוציטים אנדותל ממלאות תפקיד מרכזי במחלות דלקתיות אלה. במהלך דלקת, שחרור של PAMPS (דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן) מפתוגנים או DAMPS (דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק) מרקמות פגומות להפעיל תאים חיסוניים כדי לשחרר ציטוקינים / כימותרפים ומתווכים פרואינפלמטוריים אחרים המובילים להפעלת אנדותל, וכתוצאה מכך שינויים בתפקוד מחסום אנדותל כלי הדם וחדירות מוגברת 3,4 . הפעלה מוגברת של תאי אנדותל במהלך דלקת גורמת לאינטראקציה משופרת בין תאי לויקוציטים אנדותל המובילים להגירה מופרזת של לויקוציטים מופעלים על פני אנדותל כלי הדם לאיברים מרכזיים 1,5,6,7.
הגיוס של לויקוציטים הוא ביוזמת כימותרפיה מגוונת מבחינה כימית המורכב שומנים ביואקטיביים, ציטוקינים, כימותרפיה ורכיבים משלימים 8,9. גיוס לויקוציטים הוא תהליך רב-שלבי הכולל חמישה שלבים נפרדים: 1) שולי לויקוציטים ולכידה/קובץ מצורף, 2) מתגלגלים, 3) מעצר מוצק, 4) התפשטות וזחילה ו-5) אקסטרווגנציה/הגירה (איור 1). כל שלב בתהליך זה דורש הצלבות בין לויקוציטים לתאי אנדותל כדי לתזמר תופעה דינמית זו 1,9. בסופו של דבר, לויקוציטים שנעצרו מתפשטים לרקמות מודלקות על פני אנדותל באמצעות תהליך רב-שלבי הנשלט על ידי אותות תלויי כימותרפיה בו זמנית, אירועי דבק וכוחות גזירה המודינמיים 1,9,10,10,11,12.
בהתחשב בתפקיד המרכזי של מתח גזירה בוויסות תפקוד התא האנדותל ואת המשמעות של אינטראקציות תא לויקוציט-אנדותל13, מספר מודלים במבחנה פותחו במהלך העשורים האחרונים כדי ללמוד היבטים שונים של מפל הגירת לויקוציטים בסביבה מבוקרת יותר14. מכשירים נוזליים מסורתיים לחקר אינטראקציות תאי לויקוציטים-אנדותל יכולים להיות מסווגים לשתי קטגוריות רחבות14: א) התקנים לחקר גלגול לויקוציטים, ביטוי מולקולת הידבקות והידבקות כגון תאי זרימת צלחת מקבילים ו- b) התקנים לחקר נדידת לויקוציטים בתנאים סטטיים כגון תאי טרנסוול. מערכות כמו תאי זרימת לוחות מקבילים שימשו לחקר התפקידים של מולקולות הידבקות והליגנדים שלהם במפל ההדבקה תחת כוחות גזירה15. עם זאת, חיסרון משמעותי הוא כי אלה מכשירים פשטניים, אידיאליזציה (למשל, ערוץ ישר) אינם מסוגלים לשחזר את קנה המידה והגיאומטריה של microvasculature in vivo (למשל, bifurcations כלי דם רצופים, מורפולוגיה וסקולרית) ואת תנאי הזרימה וכתוצאה מכך (למשל, מתכנס או מתפצל זרמים ב bifurcations). כתוצאה מכך, התקנים אלה יכולים רק מודל הידבקות אבל לא טרנסגנציה. חדרי טרנסוול יכולים ללמוד הגירה רק בתנאים סטטיים מבלי לקחת בחשבון את התכונות הגיאומטריות של in vivo ותנאי הזרימה. לפיכך, מודלים מסורתיים אלה אינם מחקים את המיקרו-סביבה של רקמות חיות או פותרים הידבקות ונדידה מדורגת בבדיקה אחת6.
כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו ואימתנו בהרחבה בדיקה מיקרופלואידית ביומימטית תלת-ממדית (bMFA) (איור 2), אשר מתרבה באופן מציאותי ברשתות מיקרו-וסקולריות של vivo על שבב 16,17,18. הפרוטוקול עבור microfabrication של מכשיר זה פורסם בעבר17 והוא מתואר רק בקצרה כאן. microvasculature של שריר קרמאסטר העכבר היה דיגיטציה באמצעות מערכת מידע גיאוגרפית שונה (GIS) גישה19. לאחר מכן, רשת המיקרו-וסקולרית הסינתטית נוצרה על פולידימתילסילוקסן (PDMS) באמצעות תהליכי ליטוגרפיה רכה המבוססים על רשת מיקרו-וסקולרית דיגיטלית 14,17,20,20,21,22. בקצרה, תמונות הרשת הדיגיטליות הודפסו על סרט Mylar, אשר שימש אז כמסכה כדי דפוס SU-8 פוטורזיסט חיובי על גבי רקיק סיליקון כדי ליצור את המאסטרים לייצור. עמודים microfabricated (קוטר 10 מיקרומטר, 3 מיקרומטר גבוה) שימשו ליצירת 3 מיקרומטר גבוה ו 100 מיקרומטר רחב נקבוביות, גודל אופטימלי עבור נדידת לויקוציטים 23,24,25, חיבור ערוצי כלי הדם ותאי הרקמות. PDMS הוכן על פי הוראות היצרן ושפך על המאסטרים המפותחים. יתר על כן, PDMS היה degassed והורשה לרפא לילה בתנור (65 °C (65 °F) כדי ליצור microchannels משלימים PDMS. לאחר מכן, PDMS נרפא היה קלוף מן מאסטר SU-8, ואחריו יציאות ניקוב עבור מפרצונים / שקעים. לאחר מכן, PMDS היה פלזמה מלוכד למגלשת זכוכית. פני השטח של המכשיר המיקרופלואידי כוללים זכוכית מקורית ו- PDMS. על מנת לקדם התקשרות לתאים, התפשטות והתפשטות, נדרש ציפוי מטריצה חוץ-סלוארית (ECM). ה-bMFA כולל רשת מיקרו-וסקולרית ותא רקמות המחובר באמצעות 3 מיקרומטר גבוה ונקבוביות רחבות של 100 מיקרומטר (איור 2). מערכת מיקרופלואידית זו משחזרת את כל מפל ההדבקה/הגירה של לויקוציטים בסביבה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית של רשת מיקרו-וסקולרית שלמה עם כלי חיבור וביזורים, כולל מחזור דם, שוליים, גלגול, הידבקות ונדידה של לויקוציטים לתא רקמת כלי הדם החוץ-וסקולריים במערכת אחת 14,16,17,21,26.
יש לציין כי גם כאשר קצב הזרימה בכניסה של bMFA קבוע, תנאי הזרימה ברשת משתנים במיקומים שונים ולא ניתן לחשב על ידי נוסחה מתמטית פשוטה. פותח מודל מבוסס דינמיקת נוזלים חישובית (CFD) כדי לחשב פרמטרי זרימה שונים (לדוגמה, לחץ גזירה, קצב הטיה, מהירות) במיקומים שונים ברשת. מודל CFD זה שימש כדי לדמות את דפוסי זלוף הצבע ואת פרמטרי הזרימה ב- bMFA. אימות צולב עם תוצאות ניסיוניות העלה כי התנגדויות הזרימה ברחבי הרשת מנבאות היטב על ידי המודל החישובי (איור 3)17. מודל CFD זה שימש אז להערכת פרופיל המהירות וקצב הגזירה בכל כלי של bMFA (איור 4), המאפשר ניתוח של ההשפעות של זרימת גזירה וגיאומטריה על גלגול לויקוציטים, הידבקות והגירה16. לויקוציטים מעדיפים לדבוק ליד bifurcations ובאזורי גזירה נמוכה ב vivo, ודפוסים מרחביים אלה של הידבקות לויקוציטים הודגמו בהצלחה bMFA באמצעות נויטרופילים (איור 5)16. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול להכנת bMFA לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל בתנאים דלקתיים באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות (HLMVEC) ונויטרופילים אנושיים. מערכות מיקרופיזיולוגיות, כגון bMFA, יכולות לשמש לחקר אינטראקציות תאי אנדותל עם סוגים שונים של תאים כגון נויטרופילים, מונוציטים, לימפוציטים ותאי גידול 18,27,28,29,30. ניתן לזרוע את ה- bMFA עם תאי אנדותל ראשוניים מאיברים שונים (למשל, ריאה מול מוח) ומינים שונים (למשל, תאי אנדותל אנושיים לעומת תאי מורין), כמו גם קווי תאי אנדותל 21,27,31,32. ניתן להשתמש ב- bMFA כדי לחקור תגובות תאיות מרובות, אינטראקציות בין תאים, תפקוד מחסום, משלוח סמים ורעילות סמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ה- bMFA משחזר את הטופוגרפיה ואת תנאי הזרימה של רשתות מיקרו-וסקולריות in vivo וניתן להשתמש בו כדי ללמוד אינטראקציה תאי לויקוציטים אנדותל ותפקוד אנדותל במבחנה בתנאים מציאותיים מבחינה פיזיולוגית. במיקרו-וואסקטור של עכבר או אדם, הגיאומטריה של רשתות המיקרו-וסקולריות דומה לעצמם ופרקטלית, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק: GM1114359 ו- GM134701 (M.F.K. ו- L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), והסוכנות להפחתת איומי הגנה, מספר מענק: HDTRA11910012 (M.F.K. ו- L.E.K.).
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
