Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione
Summary
In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l’intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.
Abstract
Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie come la sepsi. Durante l’infiammazione, l’eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l’endotelio vascolare negli organi chiave può portare a insufficienza d’organo. Un saggio microfluidico biomimetico fisiologicamente rilevante (bMFA) è stato sviluppato e validato utilizzando diverse tecniche sperimentali e computazionali, in grado di riprodurre l’intera cascata di rotolamento/adesione/migrazione leucocitaria per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale. Le reti microvascolari ottenute da immagini in vivo nei roditori sono state digitalizzate utilizzando un approccio Geographic Information System (GIS) e microfabbricate con polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino per microscopio. Per studiare l’effetto della velocità di taglio e della topologia vascolare sulle interazioni leucocita-cellula endoteliale, è stato sviluppato un modello di fluidodinamica computazionale (CFD) per generare una mappa corrispondente delle velocità e delle velocità di taglio in tutta la rete. Il bMFA consente la quantificazione delle interazioni leucociti-cellule endoteliali, tra cui la velocità di rotolamento, il numero di leucociti aderenti in risposta a diverse velocità di taglio, il numero di leucociti migrati, la permeabilità delle cellule endoteliali, l’espressione della molecola di adesione e altre variabili importanti. Inoltre, utilizzando campioni correlati all’uomo, come cellule endoteliali umane e leucociti, bMFA fornisce uno strumento per lo screening rapido di potenziali terapie per aumentare la loro traducibilità clinica.
Introduction
L’infiammazione è la risposta dell’ospite a infezioni e lesioni e l’endotelio svolge un ruolo importante nella risposta infiammatoria 1,2,3. La disregolazione infiammatoria è la causa alla base di una serie di patologie come sepsi, malattie cardiovascolari, asma, malattie infiammatorie intestinali, cancro e COVID-19. Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo centrale in queste malattie infiammatorie. Durante l’infiammazione, il rilascio di PAMPS (pathogen-associated molecular patterns) da patogeni o DAMPS (pattern molecolari associati al danno) da tessuti danneggiati attiva le cellule immunitarie per rilasciare citochine/chemochine e altri mediatori proinfiammatori che portano all’attivazione dell’endotelio, con conseguenti alterazioni della funzione di barriera dell’endotelio vascolare e aumento della permeabilità 3,4 . L’aumento dell’attivazione delle cellule endoteliali durante l’infiammazione si traduce in una maggiore interazione leucocita-cellula endoteliale che porta a un’eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l’endotelio vascolare negli organi chiave 1,5,6,7.
Il reclutamento dei leucociti è iniziato da chemioattrattivi chimicamente diversi composti da lipidi bioattivi, citochine, chemochine e componenti del complemento 8,9. Il reclutamento dei leucociti è un processo in più fasi che comprende cinque fasi discrete: 1) marginazione e cattura/attaccamento dei leucociti, 2) rotolamento, 3) arresto fermo, 4) diffusione e strisciamento e 5) stravaso/migrazione (Figura 1). Ogni fase di questo processo richiede una diafonia tra leucociti e cellule endoteliali per orchestrare questo fenomeno dinamico 1,9. In definitiva, i leucociti arrestati si estfusionano ai tessuti infiammati attraverso l’endotelio attraverso un processo a più fasi controllato da segnali chemioattratturanti-dipendenti concorrenti, eventi adesivi e forze di taglio emodinamiche 1,9,10,11,12.
Dato il ruolo centrale dello stress da taglio nella regolazione della funzione delle cellule endoteliali e il significato delle interazioni leucocita-cellule endotelio13, negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi modelli in vitro per studiare vari aspetti della cascata di migrazione dei leucociti in un ambiente più controllato14. I dispositivi fluidici tradizionali per studiare le interazioni leucocita-cellula endoteliale possono essere classificati in due grandi categorie14: a) dispositivi per lo studio del rotolamento dei leucociti, dell’adesione e dell’espressione delle molecole di adesione come le camere di flusso a piastre parallele e b) dispositivi per lo studio della migrazione dei leucociti in condizioni statiche come le camere transwell. Sistemi come le camere di flusso a piastre parallele sono stati utilizzati per studiare i ruoli delle molecole di adesione e dei loro ligandi nella cascata di adesione sotto le forze di taglio15. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che questi dispositivi semplicistici e idealizzati (ad esempio, canale dritto) non sono in grado di riprodurre la scala e la geometria della microvascolarizzazione in vivo (ad esempio, biforcazioni vascolari successive, morfologia vascolare) e le condizioni di flusso risultanti (ad esempio, flussi convergenti o divergenti a biforcazioni). Di conseguenza, questi dispositivi possono solo modellare l’adesione ma non la trasmigrazione. Le camere Transwell possono studiare la trasmigrazione solo in condizioni statiche senza considerare le caratteristiche geometriche in vivo e le condizioni di flusso. Pertanto, questi modelli tradizionali non imitano il microambiente dei tessuti viventi o risolvono l’adesione e la migrazione a cascata in un singolo saggio6.
Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato e ampiamente convalidato un nuovo saggio microfluidico biomimetico 3D (bMFA) (Figura 2), che riproduce realisticamente reti microvascolari in vivo su un chip 16,17,18. Il protocollo per la microfabbricazione di questo dispositivo è stato pubblicato in precedenza17 ed è solo brevemente descritto qui. La microvascolarizzazione del muscolo cremaster del topo è stata digitalizzata utilizzando un approccio GIS (Geographic Information System) modificato19. Quindi, la rete microvascolare sintetica è stata generata sul polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando processi di litografia morbida basati sulla rete microvascolare digitalizzata 14,17,20,21,22. In breve, le immagini di rete digitalizzate sono state stampate su pellicola Mylar, che è stata poi utilizzata come maschera per modellare un fotoresist positivo SU-8 sopra un wafer di silicio per creare i master per la fabbricazione. I pilastri microfabbricati (diametro 10 μm, 3 μm di altezza) sono stati utilizzati per creare i pori alti 3 μm e larghi 100 μm, una dimensione ottimale per la migrazione dei leucociti 23,24,25, collegando i canali vascolari e i compartimenti tissutali. PDMS è stato preparato secondo le istruzioni del produttore e versato sui master sviluppati. Inoltre, il PDMS è stato degassato e lasciato polimerizzare durante la notte in un forno (65 ° C) per creare microcanali complementari in PDMS. Successivamente, il PDMS polimerizzato è stato staccato dal master SU-8, seguito da porte di punzonatura per ingressi / uscite. Quindi, il PMDS è stato plasmato legato a un vetrino. La superficie del dispositivo microfluidico comprende vetro nativo e PDMS. Al fine di promuovere l’attaccamento, la diffusione e la proliferazione cellulare, è necessario il rivestimento a matrice extracellulare (ECM). Il bMFA comprende una rete microvascolare e un compartimento tissutale collegato tramite pori alti 3 μm e larghi 100 μm (Figura 2). Questo sistema microfluidico riproduce l’intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante di una rete microvascolare completa con vasi interconnessi e biforcazioni, tra cui circolazione, marginazione, rotolamento, adesione e migrazione dei leucociti nel compartimento tissutale extra-vascolare in un unico sistema 14,16,17,21,26.
Va notato che anche quando la portata all’ingresso di bMFA è fissa, le condizioni di flusso nella rete variano in posizioni diverse e non possono essere calcolate con una semplice formula matematica. È stato sviluppato un modello basato sulla fluidodinamica computazionale (CFD) per calcolare diversi parametri di flusso (ad esempio, sforzo di taglio, velocità di taglio, velocità) in diverse posizioni della rete. Questo modello CFD è stato utilizzato per simulare i modelli di perfusione del colorante e i parametri di flusso nel bMFA. La convalida incrociata con i risultati sperimentali ha suggerito che le resistenze di flusso attraverso la rete sono ben previste dal modello computazionale (Figura 3)17. Questo modello CFD è stato quindi utilizzato per stimare la velocità e il profilo della velocità di taglio in ogni vaso di bMFA (Figura 4), consentendo l’analisi degli effetti del flusso di taglio e della geometria sul rotolamento, l’adesione e la migrazione dei leucociti16. I leucociti aderiscono preferenzialmente in prossimità di biforcazioni e in regioni a basso taglio in vivo, e questi modelli spaziali di adesione leucocitaria sono stati dimostrati con successo in bMFA usando neutrofili (Figura 5)16. Questo documento descrive il protocollo per la preparazione di bMFA per studiare l’interazione leucocita-cellula endoteliale in condizioni infiammatorie utilizzando cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVEC) e neutrofili umani. I sistemi microfisiologici, come il bMFA, possono essere utilizzati per studiare le interazioni delle cellule endoteliali con diversi tipi di cellule come neutrofili, monociti, linfociti e cellule tumorali 18,27,28,29,30. Il bMFA può essere seminato con cellule endoteliali primarie di diversi organi (ad esempio, polmone vs cervello) e diverse specie (ad esempio, cellule endoteliali umane vs murine), nonché linee cellulari endoteliali 21,27,31,32. Il bMFA può essere utilizzato per studiare risposte cellulari multiple, interazioni cellula-cellula, funzione barriera, somministrazione di farmaci e tossicità del farmaco.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il bMFA riproduce la topografia e le condizioni di flusso delle reti microvascolari in vivo e può essere utilizzato per studiare l’interazione leucocita-cellula endoteliale e la funzione endoteliale in vitro in condizioni fisiologicamente realistiche. Nella microvascolarizzazione di topo o uomo, la geometria delle reti microvascolari è auto-simile e frattale, e il numero di Reynolds << 1, indicando che la geometria vascolare non influisce in modo significativo sui modelli di flusso. Pertanto, il bFMA …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 e GM134701 (M.F.K. e L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), e Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. e L.E.K.).
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
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