炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム
Summary
このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 – 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。
Abstract
白血球-内皮細胞相互作用は、敗血症などの炎症性疾患において重要な役割を果たす。炎症の間、血管内皮を横切って重要な器官への活性化白血球の過剰な移動は、器官不全につながる可能性がある。生理学的に関連する生体模倣マイクロ流体アッセイ(bMFA)が開発され、いくつかの実験的および計算的技術を使用して検証されており、白血球のローリング/接着/遊走カスケード全体を再現して白血球-内皮細胞相互作用を研究することができます。げっ歯類 のin vivo 画像から得られた微小血管網を地理情報システム(GIS)アプローチを用いてデジタル化し、顕微鏡スライド上でポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いて微細加工した。白血球-内皮細胞相互作用に対する剪断速度および血管トポロジーの影響を研究するために、計算流体力学(CFD)モデルが開発され、ネットワーク全体の剪断速度および速度の対応するマップが生成された。bMFAは、転動速度、異なる剪断速度に応答した接着白血球の数、遊走白血球の数、内皮細胞透過性、接着分子発現および他の重要な変数を含む白血球 – 内皮細胞相互作用の定量化を可能にする。さらに、ヒトリンパ管内皮細胞や白血球などのヒト関連サンプルを使用することにより、bMFAは、臨床翻訳可能性を高めるための潜在的な治療法の迅速なスクリーニングのためのツールを提供します。
Introduction
炎症は、感染および傷害に対する宿主応答であり、内皮は炎症反応において重要な役割を果たす1、2、3。炎症性調節不全は、敗血症、心血管疾患、喘息、炎症性腸疾患、癌およびCOVID-19などの多くの疾患病状の根底にある原因である。白血球 – 内皮細胞相互作用は、これらの炎症性疾患において中心的な役割を果たす。炎症中、病原体からのPAMPS(病原体関連分子パターン)または損傷組織からのDAMPS(損傷関連分子パターン)の放出は、免疫細胞を活性化してサイトカイン/ケモカインおよび内皮の活性化につながる他の炎症誘発メディエーターを放出し、血管内皮バリア機能の変化および透過性の増加をもたらす3,4.炎症中の内皮細胞の活性化の増加は、白血球−内皮細胞相互作用の増強をもたらし、血管内皮を横切って重要な器官への活性化白血球の過剰な遊走をもたらす1、5、6、7。
白血球の動員は、生理活性脂質、サイトカイン、ケモカインおよび補体成分8、9からなる化学的に多様な化学誘引物質によって開始される。白血球の募集は、1)白血球のマージニングと捕捉/付着、2)ローリング、3)確固たる逮捕、4)拡散と這い回り、5)溢血/移動(図1)の5つの個別のステップを含む多段階のプロセスです。このプロセスの各ステップは、この動的現象を調整するために白血球と内皮細胞との間のクロストークを必要とする1,9。最終的に、停止した白血球は、同時化学誘引依存性シグナル、接着事象および血行動態剪断力によって制御される多段階プロセスを介して、内皮を横切って炎症組織に溢出する1、9、10、11、12。
内皮細胞機能の調節における剪断応力の中心的な役割と白血球-内皮細胞相互作用の重要性13を考えると、より制御された環境における白血球遊走カスケードの様々な側面を研究するために、過去数十年間にいくつかの in vitro モデルが開発されてきた14。白血球 – 内皮細胞相互作用を研究するための従来の流体デバイスは、2つの広いカテゴリーに分類することができる:a)白血球圧延、接着および平行平板流チャンバなどの接着分子発現を研究するためのデバイス、およびb)トランスウェルチャンバなどの静的条件下での白血球遊走を研究するためのデバイス。平行平板フローチャンバのようなシステムは、剪断力15の下での接着カスケードにおける接着分子およびその配位子の役割を研究するために使用されてきた。しかしながら、重大な欠点は、これらの単純化された理想化された装置(例えば、直線チャネル)が、 インビボ 微小血管系のスケールおよび幾何学的形状(例えば、連続する血管分岐、血管形態)および結果として生じる流れ条件(例えば、分岐部における収束または発散流)を再現することができないことである。その結果、これらのデバイスは接着のみをモデル化でき、トランスマイグレーションはモデル化できません。トランスウェルチャンバーは、 in vivo の幾何学的特徴および流れ条件を考慮することなく、静的条件下でのみトランスマイグレーションを研究することができる。したがって、これらの従来のモデルは、生体組織の微小環境を模倣したり、単一のアッセイで接着および遊走カスケードを解決したりしない6。
この制限に対処するために、我々は、チップ上の生体内微小血管ネットワークを現実的に再現する新規な3D生体模倣マイクロ流体アッセイ(bMFA)(図2)を開発し、広範囲に検証した16、17、18。このデバイスの微細加工のためのプロトコルは、以前に17で公開されており、ここでは簡単に説明されています。マウスクレマスター筋の微小血管系を、修正地理情報システム(GIS)アプローチ19を用いてデジタル化した。次いで、合成微小血管網を、デジタル化された微小血管網14、17、20、21、22に基づくソフトリソグラフィープロセスを用いて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)上に生成した。簡単に言えば、デジタル化されたネットワーク画像をマイラーフィルムに印刷し、それをマスクとして使用して、シリコンウェーハの上にSU-8ポジ型フォトレジストをパターニングし、製造用のマスターを作成しました。微細加工されたピラー(直径10μm、高さ3μm)を用いて、高さ3μm、幅100μmの細孔を作成し、白血球遊走に最適なサイズ23、24、25、血管チャネルと組織区画を接続した。PDMSはメーカーの指示に従って調製され、開発されたマスターに注がれました。さらに、PDMSを脱気し、オーブン(65°C)中で一晩硬化させて、PDMS中に相補的なマイクロチャネルを作成した。続いて、硬化したPDMSをSU-8マスターから剥離し、続いて入口/出口用のパンチングポートを取り付けた。次いで、PMDSをスライドガラスにプラズマ接合した。マイクロ流体装置の表面は、天然ガラスおよびPDMSを含む。細胞の付着、拡散および増殖を促進するためには、細胞外マトリックス(ECM)コーティングが必要である。bMFAには、微小血管網と、高さ3μm、幅100μmの細孔を介して接続された組織区画が含まれています(図2)。このマイクロ流体システムは、循環、縁取り、転がり、接着および単一系における血管外組織区画への白血球の移動を含む、相互接続された血管および分岐を有する完全な微小血管網の生理学的に関連する3D環境における白血球接着/遊走カスケード全体を再現する14,16,17,21,26。
なお、bMFAの入口の流量が固定されていても、ネットワーク内の流動条件は場所によって異なり、単純な数式では計算できない。計算流体力学(CFD)ベースのモデルが開発され、ネットワーク内のさまざまな場所でさまざまな流れパラメータ(せん断応力、せん断速度、速度など)が計算されました。このCFDモデルは、bMFAの色素灌流パターンと流れパラメータをシミュレートするために使用されました。実験結果との交差検証により、ネットワーク全体の流れ抵抗は計算モデルによって十分に予測されることが示唆されました(図3)17。次に、このCFDモデルを使用して、bMFAのすべての容器における速度およびせん断速度プロファイルを推定し(図4)、白血球の圧延、接着および移動に対するせん断流および幾何学的形状の影響の分析を可能にした16。白血球は、分岐点の近くおよび生体内の低剪断領域において優先的に接着し、白血球接着のこれらの空間パターンは、好中球を用いたbMFAにおいて首尾よく実証された(図5)16。本稿では、ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)およびヒト好中球を用いて炎症条件下で白血球-内皮細胞相互作用を研究するためのbMFAを調製するためのプロトコールについて記載する。bMFAなどの微生理学的システムは、好中球、単球、リンパ球および腫瘍細胞などの異なるタイプの細胞との内皮細胞相互作用を研究するために使用することができる18、27、28、29、30。bMFAを、異なる器官(例えば、肺対脳)および異なる種(例えば、ヒト対マウス内皮細胞)、ならびに内皮細胞株21、27、31、32からの初代内皮細胞で播種することができる。bMFAは、複数の細胞応答、細胞間相互作用、バリア機能、薬物送達および薬物毒性を研究するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
bMFAは 、in vivo微小 血管ネットワークのトポグラフィーおよび流れ条件を再現し、生理学的に現実的な条件下での白血球 – 内皮細胞相互作用および内皮機能を in vitroで 研究するために使用することができる。マウスまたはヒトのいずれかの微小血管系において、微小血管網の幾何学的形状は自己類似性およびフラクタル的であり、レイノルズ数<<1であり、血管幾何学的形状が流?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金番号:GM114359およびGM134701(M.F.K.およびL.E.K.)、1F31AI164870-01(J..C.L.)、および国防脅威低減局(Grant Number:HDTRA11910012(M.F.K.およびL.E.K.)によって支援されました。
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
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