염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템
Summary
이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.
Abstract
백혈구-내피 세포 상호작용은 패혈증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 염증 동안, 활성화된 백혈구가 혈관 내피를 가로질러 주요 기관으로 과도하게 이동하면 장기 부전이 발생할 수 있습니다. 생리학적으로 관련된 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)은 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 전체 백혈구 롤링/부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 몇 가지 실험 및 계산 기술을 사용하여 개발 및 검증되었습니다. 설치류 의 생체내 이미지로부터 얻은 미세혈관 네트워크는 지리 정보 시스템(GIS) 접근법을 사용하여 디지털화되고 현미경 슬라이드 상에서 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 미세제작되었다. 전단 속도와 혈관 토폴로지가 백혈구-내피 세포 상호작용에 미치는 영향을 연구하기 위해, 전산 유체 역학(CFD) 모델이 개발되어 네트워크 전반에 걸친 전단 속도 및 속도의 상응하는 지도를 생성하였다. bMFA는 롤링 속도, 상이한 전단 속도에 반응하는 부착된 백혈구의 수, 이동된 백혈구의 수, 내피 세포 투과성, 부착 분자 발현 및 기타 중요한 변수를 포함하는 백혈구-내피 세포 상호작용의 정량화를 가능하게 한다. 더욱이, 인간 내피 세포 및 백혈구와 같은 인간 관련 샘플을 사용함으로써, bMFA는 그들의 임상 번역성을 증가시키기 위해 잠재적인 치료제의 신속한 스크리닝을 위한 도구를 제공한다.
Introduction
염증은 감염 및 손상에 대한 숙주 반응이고, 내피는 염증 반응 1,2,3에서 중요한 역할을 한다. 염증성 조절 장애는 패혈증, 심혈관 질환, 천식, 염증성 장 질환, 암 및 COVID-19와 같은 다수의 질병 병리의 근본 원인이다. 백혈구-내피 세포 상호작용은 이러한 염증성 질환에서 중심적인 역할을 한다. 염증 동안, 손상된 조직으로부터 병원균 또는 DAMPS (손상 관련 분자 패턴)로부터의 PAMPS (병원체 관련 분자 패턴)의 방출은 면역 세포를 활성화시켜 내피의 활성화로 이어지는 사이토카인 / 케모카인 및 기타 전염증성 매개체를 방출하여 혈관 내피 장벽 기능의 변화와 투과성 증가를 초래합니다 3,4 . 염증 동안 내피 세포의 활성화가 증가하면 백혈구와 내피 세포 상호 작용이 향상되어 혈관 내피를 가로 질러 활성화 된 백혈구가 주요 기관 1,5,6,7로 과도하게 이동하게됩니다.
백혈구의 모집은 생리활성 지질, 사이토카인, 케모카인 및 보체 성분 8,9로 구성된 화학적으로 다양한 화학유인제에 의해 개시된다. 백혈구 모집은 1) 백혈구 소엽 및 포획/부착, 2) 롤링, 3) 확고한 정지, 4) 확산 및 크롤링, 5) 혈관외유출/이동(그림 1)의 다섯 가지 개별 단계를 포함하는 다단계 과정입니다. 이 과정의 각 단계는이 역동적 인 현상을 조율하기 위해 백혈구와 내피 세포 사이의 누화를 필요로합니다 1,9. 궁극적으로, 체포 된 백혈구는 동시 화학 유인 물질 의존성 신호, 접착 사건 및 혈역학적 전단력 1,9,10,11,12에 의해 제어되는 다단계 과정을 통해 내피를 가로 질러 염증 조직으로 혈관을 확장합니다.
내피 세포 기능을 조절하는 전단 스트레스의 중심 역할과 백혈구-내피 세포 상호작용의 중요성을 감안할 때(13), 보다 조절된 환경에서 백혈구 이동 캐스케이드의 다양한 측면을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 몇몇 시험관내 모델이 개발되었다(14). 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위한 전통적인 유체 장치는 두 가지광범위한 범주로 분류될 수 있다: a) 백혈구 롤링, 부착 및 부착 분자 발현을 연구하기 위한 장치, 예컨대 병렬 플레이트 유동 챔버 및 b) 트랜스웰 챔버와 같은 정적 조건 하에서 백혈구 이동을 연구하기 위한 장치. 평행 플레이트 유동 챔버와 같은 시스템은 전단력(15) 하에서의 접착 캐스케이드에서 접착 분자 및 이들의 리간드의 역할을 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 상당한 결점은 이들 단순한, 이상화된 디바이스들(예를 들어, 직선 채널)이 생체내 미세혈관구조(예를 들어, 연속적인 혈관 분기, 혈관 형태학) 및 결과적인 유동 조건(예를 들어, 분기점에서의 수렴 또는 발산 흐름)의 스케일 및 기하학적 구조를 재현할 수 없다는 것이다. 결과적으로 이러한 장치는 접착 만 모델링 할 수 있지만 트랜스 마이그레이션은 모델링 할 수 없습니다. 트랜스웰 챔버는 생체내 기하학적 특징과 유동 조건을 고려하지 않고 정적 조건하에서만 트랜스마이그레이션을 연구할 수 있다. 따라서, 이들 전통적인 모델은 살아있는 조직의 미세환경을 모방하거나 단일 분석(6)에서 부착 및 이동 캐스케이드를 해결하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 새로운 3D 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)(그림 2)을 개발하고 광범위하게 검증했으며, 이는 칩16,17,18에서 생체내 미세혈관 네트워크를 현실적으로 재현한다. 이 장치의 미세 제작을위한 프로토콜은 이전에17 년에 발표되었으며 여기에 간략하게 설명되어 있습니다. 마우스 크레마스터 근육의 미세혈관구조를 변형된 지리 정보 시스템(GIS) 접근법(19)을 사용하여 디지털화하였다. 이어서, 합성 미세혈관 네트워크는 디지털화된 미세혈관 네트워크(14,17,20,21,22)에 기초한 소프트 리소그래피 공정을 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 상에서 생성되었다. 간단히 말해서, 디지털화 된 네트워크 이미지가 Mylar 필름에 인쇄 된 다음 실리콘 웨이퍼 위에 SU-8 포지티브 포토레지스트를 패턴화하여 제작을위한 마스터를 만드는 마스크로 사용되었습니다. 미세제작된 기둥(직경 10 μm, 높이 3 μm)을 사용하여 높이 3 μm, 폭 100 μm의 기공을 만들고, 백혈구 이동을 위한 최적 크기 23,24,25를 혈관 채널과 조직 구획을 연결하였다. PDMS는 제조업체의 지시에 따라 제조되고 개발 된 마스터 위에 쏟아졌습니다. 또한, PDMS를 탈기시키고 오븐(65°C)에서 밤새 경화시켜 PDMS에 상보성 마이크로채널을 생성하였다. 그 후, 경화 된 PDMS를 SU-8 마스터에서 벗겨 낸 다음 입구 / 출구 용 펀칭 포트를 펀칭했습니다. 이어서, PMDS를 유리 슬라이드에 플라즈마 접합시켰다. 미세유체 장치의 표면은 천연 유리 및 PDMS를 포함한다. 세포 부착, 확산 및 증식을 촉진하기 위해, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅이 요구된다. bMFA는 3 μm 높이 및 100 μm 폭 기공을 통해 연결된 미세혈관 네트워크 및 조직 구획을 포함한다(도 2). 이 미세 유체 시스템은 단일 시스템 14,16,17,21,26에서 백혈구의 순환, 마진, 롤링, 부착 및 백혈구의 순환, 마진, 롤링, 부착 및 이동을 포함하여 상호 연결된 혈관 및 분기와 함께 완전한 미세 혈관 네트워크의 생리 학적으로 관련된 3D 환경에서 전체 백혈구 부착 / 이동 캐스케이드를 재현합니다14,16,17,21,26.
bMFA 입구의 유속이 고정되어있는 경우에도 네트워크의 흐름 조건은 다른 위치에서 다양하며 간단한 수학 공식으로 계산할 수 없다는 점에 유의해야합니다. 전산 유체 역학 (CFD) 기반 모델은 네트워크의 다른 위치에서 다른 흐름 매개 변수 (예 : 전단 응력, 전단 속도, 속도)를 계산하기 위해 개발되었습니다. 이 CFD 모델은 bMFA에서 염료 관류 패턴 및 유동 파라미터를 시뮬레이션하는데 사용되었다. 실험 결과와의 교차 검증은 네트워크를 통한 흐름 저항이 계산 모델에 의해 잘 예측된다는 것을 시사했습니다(그림 3)17. 이 CFD 모델은 bMFA의 모든 용기에서 속도 및 전단 속도 프로파일을 추정하는 데 사용되었으며(그림 4), 백혈구 롤링, 부착 및 이동에 대한 전단 흐름 및 기하학적 구조의 영향을 분석할 수 있습니다(16). 백혈구는 생체내에서 분기 근처 및 낮은 전단 영역에서 우선적으로 부착되며, 백혈구 부착의 이러한 공간적 패턴은 호중구를 사용하는 bMFA에서 성공적으로 입증되었다(도 5)16. 이 논문은 인간 폐 미세혈관 내피 세포 (HLMVEC) 및 인간 호중구를 사용하는 염증 조건 하에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 bMFA를 제조하기 위한 프로토콜을 기술한다. bMFA와 같은 미세 생리학적 시스템은 호중구, 단핵구, 림프구 및 종양 세포 18,27,28,29,30과 같은 상이한 유형의 세포와의 내피 세포 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. bMFA는 상이한 기관 (예를 들어, 폐 대 뇌) 및 상이한 종 (예를 들어, 인간 대 뮤린 내피 세포) 뿐만 아니라 내 피 세포주 21,27,31,32로부터의 일차 내피 세포와 함께 시딩될 수 있다. bMFA는 다중 세포 반응, 세포-세포 상호작용, 장벽 기능, 약물 전달 및 약물 독성을 연구하는데 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
bMFA는 생체내 미세혈관 네트워크의 지형 및 유동 조건을 재생하고, 생리학적으로 현실적인 조건 하에서 시험관내에서 백혈구-내피 세포 상호작용 및 내피 기능을 연구하는데 사용될 수 있다. 마우스 또는 인간의 미세 혈관 구조에서 미세 혈관 네트워크의 기하학은 자기 유사하고 프랙탈이며, 레이놀즈 번호<< 1로 혈관 기하학이 흐름 패턴에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health), 보조금 번호 : GM114359 및 GM134701 (M.F.K. 및 L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), 국방 위협 감소 기관, 보조금 번호 : HDTRA11910012 (M.F.K. 및 L.E.K.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
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