Микрофизиологическая система для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток при воспалении
Summary
В этом протоколе биомиметический микрофлюидный анализ, который может воспроизводить физиологически значимую микрососудистую среду и воспроизводить весь каскад адгезии / миграции лейкоцитов, используется для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток при воспалительных заболеваниях.
Abstract
Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет важную роль при воспалительных заболеваниях, таких как сепсис. Во время воспаления чрезмерная миграция активированных лейкоцитов через эндотелий сосудов в ключевые органы может привести к органной недостаточности. Физиологически значимый биомиметический микрофлюидный анализ (bMFA) был разработан и подтвержден с использованием нескольких экспериментальных и вычислительных методов, которые могут воспроизводить весь каскад перекатки /адгезии/миграции лейкоцитов для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Микрососудистые сети, полученные из изображений in vivo у грызунов, были оцифрованы с использованием подхода Географической информационной системы (ГИС) и микрофабрикованы с полидиметилсилоксаном (PDMS) на слайде микроскопа. Для изучения влияния скорости сдвига и сосудистой топологии на взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток была разработана модель вычислительной гидродинамики (CFD) для создания соответствующей карты скоростей сдвига и скоростей по всей сети. bMFA позволяет количественно оценивать взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток, включая скорость качения, количество прилипших лейкоцитов в ответ на различные скорости сдвига, количество мигрирующих лейкоцитов, проницаемость эндотелиальных клеток, экспрессию молекул адгезии и другие важные переменные. Кроме того, используя связанные с человеком образцы, такие как эндотелиальные клетки человека и лейкоциты, bMFA предоставляет инструмент для быстрого скрининга потенциальных терапевтических средств для повышения их клинической переводимости.
Introduction
Воспаление является ответом хозяина на инфекцию и травму, а эндотелий играет важную роль в воспалительной реакции 1,2,3. Воспалительная дисрегуляция является основной причиной ряда патологий заболеваний, таких как сепсис, сердечно-сосудистые заболевания, астма, воспалительные заболевания кишечника, рак и COVID-19. Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет центральную роль в этих воспалительных заболеваниях. Во время воспаления высвобождение PAMPS (патоген-ассоциированных молекулярных паттернов) из патогенов или DAMPS (связанных с повреждением молекулярных паттернов) из поврежденных тканей активирует иммунные клетки для высвобождения цитокинов / хемокинов и других провоспалительных медиаторов, которые приводят к активации эндотелия, что приводит к изменениям в барьерной функции эндотелия сосудов и повышению проницаемости 3,4 . Повышенная активация эндотелиальных клеток при воспалении приводит к усилению взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток, что приводит к чрезмерной миграции активированных лейкоцитов через эндотелий сосудов в ключевые органы 1,5,6,7.
Рекрутирование лейкоцитов инициируется химически разнообразными хемоаттрактантантами, состоящими из биологически активных липидов, цитокинов, хемокинов и компонентов комплемента 8,9. Рекрутирование лейкоцитов представляет собой многоступенчатый процесс, который включает в себя пять дискретных этапов: 1) маржинирование и захват/прикрепление лейкоцитов, 2) прокатка, 3) твердая остановка, 4) распространение и ползание и 5) экстравазация/миграция (рисунок 1). Каждый этап этого процесса требует перекрестных помех между лейкоцитами и эндотелиальными клетками для оркестровки этого динамического явления 1,9. В конечном счете, арестованные лейкоциты экстравазируются в воспаленные ткани через эндотелий с помощью многоступенчатого процесса, контролируемого одновременными химиоаттруктант-зависимыми сигналами, адгезивными событиями и гемодинамическими сдвиговыми силами 1,9,10,11,12.
Учитывая центральную роль сдвигового стресса в регулировании функции эндотелиальных клеток и значимость взаимодействия лейкоцитов и эндотелий клеток13, за последние несколько десятилетий было разработано несколько моделей in vitro для изучения различных аспектов каскада миграции лейкоцитов в более контролируемой среде14. Традиционные жидкостные устройства для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток можно классифицировать на две широкие категории14: а) устройства для изучения подвижности лейкоцитов, адгезии и экспрессии молекул адгезии, такие как параллельные пластинчатые проточные камеры и б) устройства для изучения миграции лейкоцитов в статических условиях, таких как трансвеллентные камеры. Такие системы, как параллельные пластинчатые проточные камеры, использовались для изучения роли молекул адгезии и их лигандов в каскаде адгезии при силах сдвига15. Однако существенным недостатком является то, что эти упрощенные, идеализированные устройства (например, прямой канал) не способны воспроизводить масштаб и геометрию микроциркуляторного русла in vivo (например, последовательные сосудистые бифуркации, морфологию сосудов) и результирующие условия потока (например, сходящиеся или расходящиеся потоки при бифуркациях). В результате эти устройства могут моделировать только адгезию, но не трансмиграцию. Трансвелл-камеры могут изучать только трансмиграцию в статических условиях без учета геометрических особенностей in vivo и условий потока. Таким образом, эти традиционные модели не имитируют микроокружение живых тканей и не разрешают каскад адгезии и миграции в одном анализе6.
Чтобы устранить это ограничение, мы разработали и тщательно проверили новый 3D-биомиметический микрофлюидный анализ (bMFA) (рисунок 2), который реалистично воспроизводит микрососудистые сети in vivo на чипе 16,17,18. Протокол микропроизводства этого устройства был опубликован ранее17 и лишь кратко описан здесь. Микроциркуляторное русло мышиной кремастерной мышцы было оцифровано с использованием модифицированного подхода19 Географической информационной системы (ГИС). Затем синтетическую микрососудистую сеть генерировали на полидиметилсилоксане (PDMS) с помощью процессов мягкой литографии на основе оцифрованной микрососудистой сети 14,17,20,21,22. Вкратце, оцифрованные сетевые изображения были напечатаны на майларовой пленке, которая затем использовалась в качестве маски для создания положительного фоторезиста СУ-8 поверх кремниевой пластины для создания мастеров для изготовления. Микрофабрикированные столбы (диаметр 10 мкм, высота 3 мкм) использовались для создания пор высотой 3 мкм и шириной 100 мкм, оптимального размера для миграции лейкоцитов 23,24,25, соединяющих сосудистые каналы и тканевые отсеки. ПДМС готовили по инструкции производителя и заливали над разработанными мастерами. Кроме того, PDMS дегазировали и позволяли отверждать в течение ночи в печи (65 ° C) для создания дополнительных микроканалов в PDMS. Впоследствии отвержденный ПДМС отклеивали от капитана СУ-8 с последующей штамповкой отверстий для входов/розеток. Затем PMDS был плазменным соединением со стеклянным слайдом. Поверхность микрофлюидного устройства содержит нативное стекло и PDMS. Чтобы способствовать прикреплению, распространению и пролиферации клеток, требуется покрытие внеклеточной матрицы (ECM). bMFA включает микрососудистую сеть и тканевой компартмент, соединенный через поры высотой 3 мкм и шириной 100 мкм (рисунок 2). Эта микрофлюидная система воспроизводит весь каскад адгезии/миграции лейкоцитов в физиологически значимой 3D-среде полной микрососудистой сети со взаимосвязанными сосудами и бифуркациями, включая циркуляцию, маржинацию, прокатку, адгезию и миграцию лейкоцитов во внесосудистый тканевой компартмент в единую систему 14,16,17,21,26.
Следует отметить, что даже при фиксированном расходе на входе bMFA условия потока в сети изменяются в разных местах и не могут быть рассчитаны по простой математической формуле. Была разработана модель на основе вычислительной гидродинамики (CFD) для расчета различных параметров потока (например, напряжения сдвига, скорости сдвига, скорости) в разных местах сети. Эта модель CFD использовалась для моделирования паттернов перфузии красителя и параметров потока в bMFA. Перекрестная валидация с экспериментальными результатами показала, что сопротивления потока по сети хорошо предсказаны вычислительной моделью (рисунок 3)17. Эта модель CFD затем использовалась для оценки скорости и профиля скорости сдвига в каждом сосуде bMFA (рисунок 4), что позволило проанализировать влияние сдвигового потока и геометрии на крение лейкоцитов, адгезию и миграцию16. Лейкоциты преимущественно прилипают вблизи бифуркации и в областях с низким сдвигом in vivo, и эти пространственные паттерны адгезии лейкоцитов были успешно продемонстрированы в bMFA с использованием нейтрофилов (рисунок 5)16. В данной работе описан протокол подготовки bMFA для изучения взаимодействия лейкоцитарно-эндотелиальных клеток при воспалительных состояниях с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека (HLMVEC) и нейтрофилов человека. Микрофизиологические системы, такие как bMFA, могут быть использованы для изучения взаимодействия эндотелиальных клеток с различными типами клеток, такими как нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и опухолевые клетки 18,27,28,29,30. bMFA может быть засеян первичными эндотелиальными клетками из разных органов (например, легких против мозга) и различных видов (например, человеческие и мышиные эндотелиальные клетки), а также эндотелиальными клеточными линиями 21,27,31,32. bMFA может быть использован для изучения множественных клеточных реакций, клеточно-клеточных взаимодействий, барьерной функции, доставки лекарств и токсичности лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
bMFA воспроизводит топографию и условия течения микрососудистых сетей in vivo и может быть использован для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток и функции эндотелия in vitro в физиологически реалистичных условиях. В микроциркуляторном русле мыши или человека г…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения, номер гранта: GM114359 и GM134701 (M.F.K. и L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), и Агентством по уменьшению угрозы обороны, номер гранта: HDTRA11910012 (M.F.K. и L.E.K.).
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
