I detta protokoll används en biomimetisk mikrofluidanalys, som kan reproducera en fysiologiskt relevant mikrovaskulär miljö och reproducera hela leukocytvidhäftningen / migrationskaskaden, för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner vid inflammatorisk sjukdom.
Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en viktig roll i inflammatoriska sjukdomar som sepsis. Under inflammation kan överdriven migration av aktiverade leukocyter över det vaskulära endotelet till nyckelorgan leda till organsvikt. En fysiologiskt relevant biomimetisk mikrofluidisk analys (bMFA) har utvecklats och validerats med hjälp av flera experimentella och beräkningstekniker, som kan reproducera hela leukocytrullningen / vidhäftningen / migrationskaskaden för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner. Mikrovaskulära nätverk erhållna från in vivo-bilder hos gnagare digitaliserades med hjälp av ett geografiskt informationssystem (GIS) -metod och mikrofabricerades med polydimetylsiloxan (PDMS) på en mikroskopbild. För att studera effekten av skjuvhastighet och vaskulär topologi på leukocyt-endotelcellinteraktioner utvecklades en CFD-modell (Computational Fluid Dynamics) för att generera en motsvarande karta över skjuvhastigheter och hastigheter i hela nätverket. bMFA möjliggör kvantifiering av interaktioner mellan leukocyt-endotelceller, inklusive rullande hastighet, antal vidhäftade leukocyter som svar på olika skjuvhastigheter, antal migrerade leukocyter, endotelcellpermeabilitet, vidhäftningsmolekyluttryck och andra viktiga variabler. Dessutom, genom att använda humanrelaterade prover, såsom humana endotelceller och leukocyter, ger bMFA ett verktyg för snabb screening av potentiella terapier för att öka deras kliniska översättningsbarhet.
Inflammation är värdens svar på infektion och skada, och endotelet spelar en viktig roll i det inflammatoriska svaret 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering är den bakomliggande orsaken till ett antal sjukdomspatologier som sepsis, hjärt-kärlsjukdomar, astma, inflammatorisk tarmsjukdom, cancer och COVID-19. Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en central roll i dessa inflammatoriska sjukdomar. Under inflammation aktiverar frisättningen av PAMPS (patogenassocierade molekylära mönster) från patogener eller DAMPS (skadeassocierade molekylära mönster) från skadade vävnader immunceller för att frigöra cytokiner/kemokiner och andra proinflammatoriska mediatorer som leder till aktivering av endotel, vilket resulterar i förändringar i vaskulär endotelbarriärfunktion och ökad permeabilitet 3,4 . Ökad aktivering av endotelceller under inflammation resulterar i förbättrad leukocyt-endotelcellinteraktion som leder till överdriven migration av aktiverade leukocyter över det vaskulära endotelet till nyckelorgan 1,5,6,7.
Rekryteringen av leukocyter initieras av kemiskt olika kemoattractanter bestående av bioaktiva lipider, cytokiner, kemokiner och komplementkomponenter 8,9. Leukocytrekrytering är en flerstegsprocess som inkluderar fem diskreta steg: 1) leukocytmarginalering och fångst / fastsättning, 2) rullande, 3) fast arrestering, 4) spridning och krypning och 5) extravasering / migration (Figur 1). Varje steg i denna process kräver överhörning mellan leukocyter och endotelceller för att orkestrera detta dynamiska fenomen 1,9. I slutändan extravaserar arresterade leukocyter till inflammerade vävnader över endotelet via en flerstegsprocess som styrs av samtidiga kemoattractantberoende signaler, limhändelser och hemodynamiska skjuvkrafter 1,9,10,11,12.
Med tanke på skjuvspänningens centrala roll vid reglering av endotelcellfunktionen och betydelsen av leukocyt-endotelcellinteraktionerna13 har flera in vitro-modeller utvecklats under de senaste decennierna för att studera olika aspekter av leukocytmigrationskaskaden i en mer kontrollerad miljö14. Traditionella fluidiska anordningar för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner kan klassificeras i två breda kategorier14: a) anordningar för att studera leukocytvalsning, vidhäftning och vidhäftningsmolekyluttryck såsom parallella plattflödeskammare och b) anordningar för att studera leukocytmigration under statiska förhållanden såsom transbrunnskammare. System som parallella plattflödeskammare har använts för att studera vidhäftningsmolekylernas roller och deras ligander i vidhäftningskaskaden under skjuvkrafter15. En signifikant nackdel är emellertid att dessa förenklade, idealiserade anordningar (t.ex. rak kanal) inte kan reproducera skalan och geometrin hos in vivo-mikrovaskulaturen (t.ex. successiva vaskulära bifurkationer, vaskulär morfologi) och de resulterande flödesförhållandena (t.ex. konvergerande eller divergerande flöden vid bifurkationer). Som ett resultat kan dessa enheter endast modellera vidhäftning men inte transmigration. Transwellkammare kan endast studera transmigration under statiska förhållanden utan att ta hänsyn till in vivo geometriska egenskaper och flödesförhållanden. Således efterliknar dessa traditionella modeller inte mikromiljön hos levande vävnader eller löser vidhäftning och migrationskaskad i en enda analys6.
För att ta itu med denna begränsning har vi utvecklat och i stor utsträckning validerat en ny 3D-biomimetisk mikrofluidisk analys (bMFA) (Figur 2), som realistiskt reproducerar in vivo mikrovaskulära nätverk på ett chip 16,17,18. Protokollet för mikrotillverkning av denna enhet har publicerats tidigare17 och beskrivs bara kortfattat här. Mikrovaskulaturen av mus cremaster muskel digitaliserades med hjälp av ett modifierat geografiskt informationssystem (GIS) tillvägagångssätt19. Därefter genererades det syntetiska mikrovaskulära nätverket på polydimetylsiloxan (PDMS) med användning av mjuka litografiprocesser baserade på det digitaliserade mikrovaskulära nätverket 14,17,20,21,22. Kortfattat trycktes de digitaliserade nätverksbilderna på Mylar-film, som sedan användes som en mask för att mönstra en SU-8-positiv fotoresist ovanpå en kiselskiva för att skapa mästarna för tillverkning. Mikrofabricerade pelare (10 μm diameter, 3 μm långa) användes för att skapa de 3 μm höga och 100 μm breda porerna, en optimal storlek för leukocytmigration 23,24,25, som förbinder kärlkanalerna och vävnadsfacken. PDMS bereddes enligt tillverkarens instruktioner och hälldes över de utvecklade mästarna. Vidare avgasades PDMS och fick härda över natten i en ugn (65 ° C) för att skapa kompletterande mikrokanaler i PDMS. Därefter skalades den härdade PDMS från SU-8-befälhavaren, följt av stansportar för inlopp / utlopp. Sedan var PMDS plasmabunden till en glasskiva. Ytan på den mikrofluidiska anordningen består av inbyggt glas och PDMS. För att främja cellbindning, spridning och proliferation krävs extracelluar matrix (ECM) beläggning. bMFA innefattar ett mikrovaskulärt nätverk och ett vävnadsfack som är anslutet via 3 μm höga och 100 μm breda porer (figur 2). Detta mikrofluidiska system reproducerar hela leukocytvidhäftnings-/migrationskaskaden i en fysiologiskt relevant 3D-miljö i ett komplett mikrovaskulärt nätverk med sammankopplade kärl och bifurkationer, inklusive cirkulation, marginalisering, valsning, vidhäftning och migration av leukocyter till det extravaskulära vävnadsfacket i ett enda system 14,16,17,21,26.
Det bör noteras att även när flödeshastigheten vid inloppet av bMFA är fixerad varierar flödesförhållandena i nätverket på olika platser och kan inte beräknas med en enkel matematisk formel. En CFD-baserad modell (Computational Fluid Dynamics) utvecklades för att beräkna olika flödesparametrar (t.ex. skjuvspänning, skjuvhastighet, hastighet) på olika platser i nätverket. Denna CFD-modell användes för att simulera färgämnets perfusionsmönster och flödesparametrar i bMFA. Korsvalidering med experimentella resultat föreslog att flödesmotstånden över nätverket är väl förutsagda av beräkningsmodellen (figur 3)17. Denna CFD-modell användes sedan för att uppskatta hastighet och skjuvhastighetsprofil i varje kärl i bMFA (figur 4), vilket möjliggjorde analys av effekterna av skjuvflöde och geometri på leukocytrullning, vidhäftning och migration16. Leukocyter fäster företrädesvis nära bifurkationer och i regioner med låg skjuvning in vivo, och dessa rumsliga mönster av leukocytvidhäftning visades framgångsrikt i bMFA med neutrofiler (figur 5)16. Detta dokument beskriver protokollet för att förbereda bMFA för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion under inflammatoriska förhållanden med användning av humana lungmikrovaskulära endotelceller (HLMVEC) och humana neutrofiler. Mikrofysiologiska system, såsom bMFA, kan användas för att studera endotelcellinteraktioner med olika typer av celler såsom neutrofiler, monocyter, lymfocyter och tumörceller 18,27,28,29,30. BMFA kan fröas med primära endotelceller från olika organ (t.ex. lunga kontra hjärna) och olika arter (t.ex. humana kontra murina endotelceller), liksom endotelcellinjer 21,27,31,32. BMFA kan användas för att studera flera cellulära svar, cell-cellinteraktioner, barriärfunktion, läkemedelsleverans och läkemedelstoxicitet.
bMFA reproducerar topografin och flödesförhållandena för de mikrovaskulära nätverken in vivo och kan användas för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion och endotelfunktion in vitro under fysiologiskt realistiska förhållanden. I mikrovaskulaturen hos antingen mus eller människa är geometrin hos de mikrovaskulära nätverken självliknande och fraktal, och Reynolds-talet << 1, vilket indikerar att vaskulär geometri inte signifikant påverkar flödesmönster. Därför kan bFMA användas …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health, grant number: GM114359 och GM134701 (M.F.K. och L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), och Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. och L.E.K.).
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
Slide clamp | SynVivo | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |