Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem
Summary
Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.
Abstract
Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri sepsis gibi inflamatuar hastalıklarda önemli rol oynamaktadır. Enflamasyon sırasında, aktif lökositlerin vasküler endotel boyunca anahtar organlara aşırı göçü organ yetmezliğine yol açabilir. Fizyolojik olarak ilgili bir biyomimetik mikroakışkan testi (bMFA), lökosit-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için tüm lökosit haddeleme / adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen çeşitli deneysel ve hesaplama teknikleri kullanılarak geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Kemirgenlerde in vivo görüntülerden elde edilen mikrovasküler ağlar, Coğrafi Bilgi Sistemi (CBS) yaklaşımı kullanılarak sayısallaştırıldı ve mikroskop slaytı üzerinde polidimetilsiloksan (PDMS) ile mikrofabrikasyona tabi tutuldu. Kesme hızının ve vasküler topolojinin lökosit-endotel hücre etkileşimleri üzerindeki etkisini incelemek için, ağ boyunca kayma hızlarının ve hızlarının karşılık gelen bir haritasını oluşturmak için bir Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) modeli geliştirilmiştir. bMFA, yuvarlanma hızı, farklı kesme oranlarına yanıt olarak yapıştırılmış lökosit sayısı, göç eden lökosit sayısı, endotel hücre geçirgenliği, adezyon molekülü ekspresyonu ve diğer önemli değişkenler dahil olmak üzere lökosit-endotel hücre etkileşimlerinin miktarını sağlar. Ayrıca, insan endotel hücreleri ve lökositler gibi insanla ilgili örnekleri kullanarak, bMFA, klinik çevrilebilirliklerini artırmak için potansiyel terapötiklerin hızlı bir şekilde taranması için bir araç sağlar.
Introduction
Enflamasyon, enfeksiyon ve yaralanmaya karşı konakçı yanıtıdır ve endotel, inflamatuar yanıtta önemli bir rol oynar 1,2,3. İnflamatuar disregülasyon, sepsis, kardiyovasküler hastalıklar, astım, inflamatuar bağırsak hastalığı, kanser ve COVID-19 gibi bir dizi hastalık patolojisinin altında yatan nedendir. Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri bu inflamatuar hastalıklarda merkezi bir rol oynamaktadır. Enflamasyon sırasında, patojenlerden PAMPS’nin (patojenle ilişkili moleküler paternler) veya hasarla ilişkili moleküler paternler) yaralı dokulardan DAMPS’lerin (hasarla ilişkili moleküler paternler) salınması, endotelin aktivasyonuna yol açan sitokinler / kemokinler ve diğer proinflamatuar mediatörleri serbest bırakmak için bağışıklık hücrelerini aktive eder, bu da vasküler endotel bariyer fonksiyonunda değişikliklere ve geçirgenliğin artmasına neden olur 3,4 . Enflamasyon sırasında endotel hücrelerinin artan aktivasyonu, artmış lökosit-endotel hücre etkileşimi ile sonuçlanır ve aktif lökositlerin vasküler endotel boyunca anahtar organlara aşırı göçüne yol açar 1,5,6,7.
Lökositlerin işe alımı, biyoaktif lipitler, sitokinler, kemokinler ve kompleman bileşenlerinden oluşan kimyasal olarak çeşitli kemoattractantlar tarafından başlatılır 8,9. Lökosit işe alımı, beş ayrı adımı içeren çok adımlı bir süreçtir: 1) lökosit marjinasyonu ve yakalama / bağlanma, 2) yuvarlanma, 3) sıkı tutuklama, 4) yayılma ve tarama ve 5) ekstravazasyon / göç (Şekil 1). Bu sürecin her adımı, bu dinamik fenomeni düzenlemek için lökositler ve endotel hücreleri arasında çapraz konuşma gerektirir 1,9. Nihayetinde, tutuklanan lökositler, eşzamanlı kemoattractant’a bağımlı sinyaller, yapışkan olaylar ve hemodinamik kesme kuvvetleri 1,9,10,11,12 tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreçle endotel boyunca iltihaplı dokulara ekstravaze olurlar.
Endotel hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde kayma stresinin merkezi rolü ve lökosit-endotel hücre etkileşimlerinin önemi göz önüne alındığında13, lökosit migrasyon kaskadının çeşitli yönlerini daha kontrollü bir ortamda incelemek için son birkaç on yılda birkaç in vitro model geliştirilmiştir14. Lökosit-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için geleneksel akışkan cihazlar iki geniş kategoriye ayrılabilir14: a) paralel plaka akış odaları gibi lökosit haddeleme, yapışma ve adezyon molekülü ekspresyonunu incelemek için cihazlar ve b) transwell odaları gibi statik koşullar altında lökosit göçünü incelemek için cihazlar. Paralel plaka akış odaları gibi sistemler, yapışma moleküllerinin ve ligandlarının kesme kuvvetleri15 altındaki yapışma kaskadındaki rollerini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, bu basit, idealize edilmiş cihazların (örneğin, düz kanal), in vivo mikrovaskülatürün ölçeğini ve geometrisini (örneğin, ardışık vaskülarjikasyonlar, vasküler morfoloji) ve sonuçta ortaya çıkan akış koşullarını (örneğin, bifurkasyonlarda yakınsak veya saptırıcı akışlar) yeniden üretememesidir. Sonuç olarak, bu cihazlar yalnızca yapışmayı modelleyebilir, ancak geçişi modelleyemez. Transwell odaları, in vivo geometrik özellikleri ve akış koşullarını dikkate almadan yalnızca statik koşullar altında transmigrasyon üzerinde çalışabilir. Bu nedenle, bu geleneksel modeller canlı dokuların mikro ortamını taklit etmez veya yapışma ve göç kaskadını tek bir tahlilde çözmez6.
Bu sınırlamayı ele almak için,16,17,18 çip üzerinde in vivo mikrovasküler ağları gerçekçi bir şekilde yeniden üreten yeni bir 3D biyomimetik mikroakışkan testi (bMFA) geliştirdik ve kapsamlı bir şekilde doğruladık. Bu cihazın mikrofabrikasyonu için protokol daha önce17 yayınlanmıştır ve burada sadece kısaca açıklanmıştır. Fare cremaster kasının mikrovaskülatürü, modifiye edilmiş bir Coğrafi Bilgi Sistemi (CBS) yaklaşımı19 kullanılarak sayısallaştırılmıştır. Daha sonra, sentetik mikrovasküler ağ, sayısallaştırılmış mikrovasküler ağ 14,17,20,21,22’ye dayanan yumuşak litografi işlemleri kullanılarak polidimetilsiloksan (PDMS) üzerinde üretildi. Kısaca, sayısallaştırılmış ağ görüntüleri Mylar filmine basıldı ve daha sonra imalat için ustalar oluşturmak için bir silikon gofret üzerine SU-8 pozitif fotodirenci modellemek için bir maske olarak kullanıldı. Mikrofabrikasyon sütunlar (10 μm çap, 3 μm boyunda), vasküler kanalları ve doku bölmelerini birbirine bağlayan lökosit migrasyonu23,24,25 için optimum boyut olan 3 μm yüksekliğinde ve 100 μm genişliğinde gözenekler oluşturmak için kullanılmıştır. PDMS, üreticinin talimatlarına göre hazırlandı ve geliştirilen ustaların üzerine döküldü. Ayrıca, PDMS gazdan arındırıldı ve PDMS’de tamamlayıcı mikro kanallar oluşturmak için bir fırında (65 ° C) gece boyunca kürlenmesine izin verildi. Daha sonra, kürlenmiş PDMS SU-8 master’dan soyuldu, ardından girişler / çıkışlar için delme portları izlendi. Daha sonra, PMDS plazma bir cam slayta bağlandı. Mikroakışkan cihazın yüzeyi doğal cam ve PDMS’den oluşur. Hücre bağlanmasını, yayılmasını ve çoğalmasını teşvik etmek için, hücre dışı matris (ECM) kaplaması gereklidir. bMFA, mikrovasküler bir ağ ve 3 μm yüksekliğinde ve 100 μm genişliğinde gözeneklerle bağlanmış bir doku bölmesi içerir (Şekil 2). Bu mikroakışkan sistem, lökositlerin dolaşımı, marjinasyonu, yuvarlanması, yapışması ve ekstravasküler doku bölmesine göçü dahil olmak üzere birbirine bağlı damarlar ve çatallanmalar ile tam bir mikrovasküler ağın fizyolojik olarak ilgili 3D ortamında tüm lökosit yapışması / migrasyon kaskadını tek bir sistemde yeniden üretir 14,16,17,21,26.
bMFA girişindeki akış hızı sabit olsa bile, ağdaki akış koşullarının farklı yerlerde değiştiği ve basit bir matematiksel formülle hesaplanamayacağı belirtilmelidir. Ağdaki farklı konumlarda farklı akış parametrelerini (örneğin, kesme gerilimi, kesme hızı, hız) hesaplamak için hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) tabanlı bir model geliştirilmiştir. Bu CFD modeli, bMFA’daki boya perfüzyon modellerini ve akış parametrelerini simüle etmek için kullanılmıştır. Deneysel sonuçlarla çapraz doğrulama, ağ üzerindeki akış dirençlerinin hesaplama modeli tarafından iyi tahmin edildiğini göstermiştir (Şekil 3)17. Bu CFD modeli daha sonra bMFA’nın her bir kabındaki hız ve kesme hızı profilini tahmin etmek için kullanıldı (Şekil 4), kesme akışının ve geometrinin lökosit haddeleme, yapışma ve migrasyon üzerindeki etkilerinin analizine izin verdi16. Lökositler tercihen bifurkasyonların yakınında ve düşük kesme bölgelerinde in vivo olarak yapışırlar ve lökosit yapışmasının bu uzamsal kalıpları nötrofiller kullanılarak bMFA’da başarıyla gösterilmiştir (Şekil 5)16. Bu yazıda, insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (HLMVEC) ve insan nötrofilleri kullanılarak enflamatuar koşullar altında lökosit-endotelyal hücre etkileşimini incelemek için bMFA’nın hazırlanması protokolü açıklanmaktadır. bMFA gibi mikrofizyolojik sistemler, nötrofiller, monositler, lenfositler ve tümör hücreleri 18,27,28,29,30 gibi farklı hücre tipleriyle endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. bMFA, farklı organlardan (örneğin, akciğere karşı beyin) ve farklı türlerden (örneğin, insan ve murin endotel hücreleri) birincil endotel hücreleri ve endotel hücre hatları21,27,31,32 ile tohumlanabilir. bMFA, çoklu hücresel yanıtları, hücre-hücre etkileşimlerini, bariyer fonksiyonunu, ilaç dağıtımını ve ilaç toksisitesini incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
bMFA, in vivo mikrovasküler ağların topografyasını ve akış koşullarını yeniden üretir ve fizyolojik olarak gerçekçi koşullar altında lökosit-endotelyal hücre etkileşimini ve endotel fonksiyonunu in vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Fare veya insanın mikrovaskülatüründe, mikrovasküler ağların geometrisi kendine benzer ve fraktaldır ve Reynolds sayısı 1′<<, vasküler geometrinin akış modellerini önemli ölçüde etkilemediğini gösterir. Bu nedenle, bFMA, insanl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Hibe Numarası: GM114359 ve GM134701 (M.F.K. ve L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.) ve Savunma Tehdidi Azaltma Ajansı, Hibe Numarası: HDTRA11910012 (M.F.K. ve L.E.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
