I denne protokollen brukes en biomimetisk mikrofluidanalyse, som kan reprodusere et fysiologisk relevant mikrovaskulært miljø og reprodusere hele leukocyttadhesjons-/migrasjonskaskaden, til å studere leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner ved inflammatorisk sykdom.
Leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner spiller en viktig rolle i inflammatoriske sykdommer som sepsis. Under betennelse kan overdreven migrering av aktiverte leukocytter over det vaskulære endotelet i nøkkelorganer føre til organsvikt. En fysiologisk relevant biomimetisk mikrofluidisk analyse (bMFA) er utviklet og validert ved hjelp av flere eksperimentelle og beregningsteknikker, som kan reprodusere hele leukocyttrullingen/adhesjonen/migrasjonskaskaden for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner. Mikrovaskulære nettverk hentet fra in vivo-bilder hos gnagere ble digitalisert ved hjelp av en Geographic Information System (GIS) tilnærming og mikrofabricated med polydimetylsiloksan (PDMS) på et mikroskop lysbilde. For å studere effekten av skjærhastighet og vaskulær topologi på leukocyte-endoteliale celleinteraksjoner, ble en COMputational Fluid Dynamics (CFD) -modell utviklet for å generere et tilsvarende kart over skjærhastigheter og hastigheter i hele nettverket. bMFA muliggjør kvantifisering av leukocytt-endoteliale celler interaksjoner, inkludert rullehastighet, antall tilhørende leukocytter som svar på forskjellige skjærhastigheter, antall migrerte leukocytter, endotelcellepermeabilitet, adhesjonsmolekyluttrykk og andre viktige variabler. Videre, ved å bruke menneskerelaterte prøver, for eksempel humane endotelceller og leukocytter, gir bMFA et verktøy for rask screening av potensielle terapeutiske behandlinger for å øke deres kliniske overførbarhet.
Betennelse er vertsresponsen på infeksjon og skade, og endotelet spiller en viktig rolle i den inflammatoriske responsen 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering er den underliggende årsaken til en rekke sykdomspatologier som sepsis, kardiovaskulære sykdommer, astma, inflammatorisk tarmsykdom, kreft og COVID-19. Leukocytt-endotelcelleinteraksjoner spiller en sentral rolle i disse inflammatoriske sykdommene. Under betennelse aktiverer frigjøringen av PAMPS (patogen-assosierte molekylære mønstre) fra patogener eller DAMPS (skaderelaterte molekylære mønstre) fra skadede vev immunceller for å frigjøre cytokiner/kjemokiner og andre proinflammatoriske mediatorer som fører til aktivering av endotel, noe som resulterer i endringer i vaskulær endotelbarrierefunksjon og økt permeabilitet 3,4 . Økt aktivering av endotelceller under betennelse resulterer i forbedret leukocytt-endotelial celleinteraksjon som fører til overdreven migrering av aktiverte leukocytter over det vaskulære endotelet i nøkkelorganer 1,5,6,7.
Rekrutteringen av leukocytter er initiert av kjemisk mangfoldige kjemoattractants sammensatt av bioaktive lipider, cytokiner, kjemokiner og komplementkomponenter 8,9. Leukocyttrekruttering er en flertrinnsprosess som inkluderer fem diskrete trinn: 1) leukocyttmarginering og fangst/vedlegg, 2) rullende, 3) fast arrestasjon, 4) spredning og kryping og 5) ekstravasasjon/migrasjon (figur 1). Hvert trinn i denne prosessen krever krysstale mellom leukocytter og endotelceller for å orkestrere dette dynamiske fenomenet 1,9. Til syvende og sist, arrestert leukocytter ekstravasat til betent vev over endotel via en flertrinnsprosess kontrollert av samtidige kjemoattractant-avhengige signaler, lim hendelser og hemodynamisk skjær tvinger 1,9,10,11,12.
Gitt den sentrale rollen av skjærspenning i regulering av endotelcellefunksjon og betydningen av leukocyte-endotelcelleinteraksjonene13, har flere in vitro-modeller blitt utviklet i løpet av de siste tiårene for å studere ulike aspekter av leukocyttmigrasjonskaskaden i et mer kontrollert miljø14. Tradisjonelle fluidiske enheter for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner kan klassifiseres i to brede kategorier14: a) enheter for å studere leukocyttrulling, vedheft og vedheft molekyluttrykk som parallelle platestrømningskamre og b) enheter for å studere leukocyttmigrasjon under statiske forhold som transwellkamre. Systemer som parallelle platestrømningskamre har blitt brukt til å studere rollene til vedheftsmolekyler og deres ligander i vedheftkaskaden under skjærkrefter15. En betydelig ulempe er imidlertid at disse forenklede, idealiserte enhetene (f.eks. rett kanal) ikke er i stand til å reprodusere skalaen og geometrien til in vivo-mikrovaskulaturen (f.eks. påfølgende vaskulære bifurkasjoner, vaskulær morfologi) og de resulterende strømningsforholdene (f.eks. konvergerende eller avvikende strømmer ved bifurkasjoner). Som et resultat kan disse enhetene bare modellere vedheft, men ikke transmigrasjon. Transwell kamre kan bare studere transmigrasjon under statiske forhold uten å vurdere in vivo geometriske egenskaper og strømningsforhold. Dermed etterligner disse tradisjonelle modellene ikke mikromiljøet av levende vev eller løser vedheft og migrasjon kaskade i en enkelt analyse6.
For å løse denne begrensningen har vi utviklet og i stor grad validert en ny 3D biomimetisk mikrofluidisk analyse (bMFA) (figur 2), som realistisk reproduserer in vivo-mikrovaskulære nettverk på enchip 16,17,18. Protokollen for mikrofabrikasjon av denne enheten har blitt publisert tidligere17 og er bare kort beskrevet her. Mikrovasculature av mus cremaster muskelen ble digitalisert ved hjelp av en modifisert Geographic Information System (GIS) tilnærming19. Deretter ble det syntetiske mikrovaskulære nettverket generert på polydimetylsiloksan (PDMS) ved hjelp av myke litografiprosesser basert på det digitaliserte mikrovaskulære nettverket 14,17,20,21,22. Kort fortalt ble de digitaliserte nettverksbildene trykt på Mylar-filmen, som deretter ble brukt som en maske for å mønstre en SU-8 positiv fotoresist på toppen av en silisiumskive for å lage mesterne for fabrikasjon. Mikrofabricated søyler (10 μm diameter, 3 μm høy) ble brukt til å skape 3 μm høy og 100 μm brede porer, en optimal størrelse for leukocytt migrasjon 23,24,25, forbinder vaskulære kanaler og vevsrom. PDMS ble utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner og helles over de utviklede mesterne. Videre ble PDMS avgasset og fikk lov til å kurere over natten i en ovn (65 °C) for å lage komplementære mikrokanaler i PDMS. Deretter ble den herdede PDMS skrelt fra SU-8-mesteren, etterfulgt av stanseporter for innløp/uttak. Deretter ble PMDS plasma bundet til et glasssklie. Overflaten på den mikrofluidiske enheten består av innfødt glass og PDMS. For å fremme celletilknytning, spredning og spredning, er det nødvendig med ekstracelluarmatrise (ECM) belegg. bMFA inkluderer et mikrovaskulært nettverk og et vevsrom koblet via 3 μm høye og 100 μm brede porer (figur 2). Dette mikrofluidiske systemet reproduserer hele leukocyttadhesjons-/migrasjonskaskaden i et fysiologisk relevant 3D-miljø i et komplett mikrovaskulært nettverk med sammenkoblede kar og bifurkasjoner, inkludert sirkulasjon, marginering, rulling, vedheft og migrasjon av leukocytter inn i det ekstra vaskulære vevsrommet i et enkelt system 14,16,17,21,21,21,21,6
Det skal bemerkes at selv når strømningshastigheten ved innløpet til bMFA er løst, varierer strømningsforholdene i nettverket på forskjellige steder og kan ikke beregnes med en enkel matematisk formel. En beregningsvæskedynamikk (CFD)-basert modell ble utviklet for å beregne forskjellige strømningsparametere (f.eks. skjærspenning, skjærhastighet, hastighet) på forskjellige steder i nettverket. Denne CFD-modellen ble brukt til å simulere fargestoffperfusjonsmønstre og strømningsparametere i bMFA. Kryssvalidering med eksperimentelle resultater antydet at strømningsmotstandene over nettverket er godt spådd av beregningsmodellen (figur 3)17. Denne CFD-modellen ble deretter brukt til å estimere hastighets- og skjærhastighetsprofil i hvert fartøy av bMFA (figur 4), noe som muliggjør analyse av effektene av skjærstrøm og geometri på leukocyttrulling, vedheft og migrasjon16. Leukocytter holder seg fortrinnsvis nær bifurkasjoner og i lave skjærregioner in vivo, og disse romlige mønstrene for leukocyttadhesjon ble vellykket demonstrert i bMFA ved hjelp av nøytrofiler (figur 5)16. Dette dokumentet beskriver protokollen for å forberede bMFA til å studere leukocytt-endotelial celleinteraksjon under inflammatoriske forhold ved hjelp av humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) og humane nøytrofiler. Mikrofysiologiske systemer, som bMFA, kan brukes til å studere endotelcelleinteraksjoner med forskjellige typer celler som nøytrofiler, monocytter, lymfocytter og tumorceller 18,27,28,29,30. bMFA kan frøs med primære endotelceller fra forskjellige organer (f.eks. lunge vs. hjerne) og forskjellige arter (f.eks. humane vs. murine endotelceller), samt endotelcellelinjer 21,27,31,32. bMFA kan brukes til å studere flere cellulære responser, cellecelleinteraksjoner, barrierefunksjon, legemiddellevering og legemiddeltoksisitet.
bMFA reproduserer topografien og strømningsforholdene til in vivo-mikrovaskulære nettverk og kan brukes til å studere leukocyte-endotelial celleinteraksjon og endotelfunksjon in vitro under fysiologisk realistiske forhold. I mikrovaskulaturen til enten mus eller menneske er geometrien til de mikrovaskulære nettverkene selvliknende og fraktal, og Reynolds-nummeret << 1, noe som indikerer at vaskulær geometri ikke påvirker strømningsmønstrene betydelig. Derfor kan bFMA brukes til å studere leukoc…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 og GM134701 (M.F.K. og L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), og Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. og L.E.K.).
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
Slide clamp | SynVivo | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |