Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación
Summary
En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.
Abstract
Las interacciones entre leucocitos y células endoteliales juegan un papel importante en enfermedades inflamatorias como la sepsis. Durante la inflamación, la migración excesiva de leucocitos activados a través del endotelio vascular hacia órganos clave puede conducir a la insuficiencia orgánica. Se ha desarrollado y validado un ensayo microfluídico biomimético fisiológicamente relevante (bMFA) utilizando varias técnicas experimentales y computacionales, que pueden reproducir toda la cascada de rodadura/adhesión/migración de leucocitos para estudiar las interacciones leucocitario-célula endotelial. Las redes microvasculares obtenidas a partir de imágenes in vivo en roedores se digitalizaron utilizando un enfoque de Sistema de Información Geográfica (SIG) y se microfabricaron con polidimetilsiloxano (PDMS) en un portaobjetos de microscopio. Para estudiar el efecto de la velocidad de cizallamiento y la topología vascular en las interacciones entre leucocitos y células endoteliales, se desarrolló un modelo de Dinámica de Fluidos Computacional (CFD) para generar un mapa correspondiente de las tasas de cizallamiento y las velocidades en toda la red. El bMFA permite cuantificar las interacciones entre leucocitos y células endoteliales, incluida la velocidad de rodadura, el número de leucocitos adheridos en respuesta a diferentes tasas de cizallamiento, el número de leucocitos migrados, la permeabilidad de las células endoteliales, la expresión de moléculas de adhesión y otras variables importantes. Además, mediante el uso de muestras relacionadas con humanos, como células endoteliales humanas y leucocitos, bMFA proporciona una herramienta para la detección rápida de posibles terapias para aumentar su traducibilidad clínica.
Introduction
La inflamación es la respuesta del huésped a la infección y la lesión, y el endotelio juega un papel importante en la respuesta inflamatoria 1,2,3. La desregulación inflamatoria es la causa subyacente de una serie de patologías de enfermedades como la sepsis, las enfermedades cardiovasculares, el asma, la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer y el COVID-19. Las interacciones leucocitarios-células endoteliales juegan un papel central en estas enfermedades inflamatorias. Durante la inflamación, la liberación de PAMPS (patrones moleculares asociados a patógenos) de patógenos o DAMPS (patrones moleculares asociados al daño) de los tejidos lesionados activa las células inmunes para liberar citoquinas / quimiocinas y otros mediadores proinflamatorios que conducen a la activación del endotelio, lo que resulta en alteraciones en la función de barrera del endotelio vascular y una mayor permeabilidad 3,4 . El aumento de la activación de las células endoteliales durante la inflamación da como resultado una mayor interacción entre leucocitos y células endoteliales, lo que lleva a una migración excesiva de leucocitos activados a través del endotelio vascular hacia órganos clave 1,5,6,7.
El reclutamiento de leucocitos es iniciado por quimioatrayentes químicamente diversos compuestos por lípidos bioactivos, citoquinas, quimiocinas y componentes del complemento 8,9. El reclutamiento de leucocitos es un proceso de varios pasos que incluye cinco pasos discretos: 1) marginación de leucocitos y captura/fijación, 2) rodaje, 3) arresto firme, 4) propagación y rastreo y 5) extravasación/migración (Figura 1). Cada paso de este proceso requiere diafonía entre leucocitos y células endoteliales para orquestar este fenómeno dinámico 1,9. En última instancia, los leucocitos detenidos extravasan a los tejidos inflamados a través del endotelio a través de un proceso de varios pasos controlado por señales concurrentes dependientes de quimioatrayentes, eventos adhesivos y fuerzas de cizallamiento hemodinámicas 1,9,10,11,12.
Dado el papel central del esfuerzo cortante en la regulación de la función de las células endoteliales y la importancia de las interacciones entre leucocitos y células endoteliales13, durante las últimas décadas se han desarrollado varios modelos in vitro para estudiar diversos aspectos de la cascada de migración de leucocitos en un entorno más controlado14. Los dispositivos fluídicos tradicionales para estudiar las interacciones entre leucocitos y células endoteliales se pueden clasificar en dos grandes categorías14: a) dispositivos para estudiar laminación de leucocitos, adhesión y expresión de moléculas de adhesión, como cámaras de flujo de placas paralelas y b) dispositivos para estudiar la migración de leucocitos en condiciones estáticas como las cámaras de transwell. Sistemas como las cámaras de flujo de placas paralelas se han utilizado para estudiar el papel de las moléculas de adhesión y sus ligandos en la cascada de adhesión bajo fuerzas de cizallamiento15. Sin embargo, un inconveniente significativo es que estos dispositivos simplistas e idealizados (por ejemplo, canal recto) no son capaces de reproducir la escala y la geometría de la microvasculatura in vivo (por ejemplo, bifurcaciones vasculares sucesivas, morfología vascular) y las condiciones de flujo resultantes (por ejemplo, flujos convergentes o divergentes en bifurcaciones). Como resultado, estos dispositivos solo pueden modelar la adhesión, pero no la transmigración. Las cámaras transwell solo pueden estudiar la transmigración en condiciones estáticas sin considerar las características geométricas in vivo y las condiciones de flujo. Por lo tanto, estos modelos tradicionales no imitan el microambiente de los tejidos vivos ni resuelven la adhesión y la cascada de migración en un solo ensayo6.
Para abordar esta limitación, hemos desarrollado y validado ampliamente un nuevo ensayo microfluídico biomimético 3D (bMFA) (Figura 2), que reproduce de manera realista las redes microvasculares in vivo en un chip16,17,18. El protocolo para la microfabricación de este dispositivo se ha publicado anteriormente17 y solo se describe brevemente aquí. La microvasculatura del músculo cremaster del ratón se digitalizó utilizando un enfoque modificado del Sistema de Información Geográfica (SIG)19. Luego, se generó la red microvascular sintética sobre polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando procesos de litografía blanda basados en la red microvascular digitalizada 14,17,20,21,22. Brevemente, las imágenes de red digitalizadas se imprimieron en una película mylar, que luego se usó como máscara para modelar una fotorresistencia positiva SU-8 sobre una oblea de silicio para crear los maestros para la fabricación. Se utilizaron pilares microfabricados (10 μm de diámetro, 3 μm de altura) para crear los poros de 3 μm de alto y 100 μm de ancho, un tamaño óptimo para la migración de leucocitos 23,24,25, conectando los canales vasculares y los compartimentos tisulares. PDMS se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se vertió sobre los maestros desarrollados. Además, el PDMS se desgasificó y se dejó curar durante la noche en un horno (65 ° C) para crear microcanales complementarios en el PDMS. Posteriormente, el PDMS curado se peló del maestro SU-8, seguido de puertos de punzonado para entradas / salidas. Luego, el PMDS se unió con plasma a un portaobjetos de vidrio. La superficie del dispositivo microfluídico comprende vidrio nativo y PDMS. Para promover la unión, propagación y proliferación celular, se requiere un recubrimiento de matriz extracelular (ECM). El bMFA incluye una red microvascular y un compartimento de tejido conectado a través de poros de 3 μm de alto y 100 μm de ancho (Figura 2). Este sistema microfluídico reproduce toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos en un entorno 3D fisiológicamente relevante de una red microvascular completa con vasos interconectados y bifurcaciones, incluyendo circulación, marginación, balanceo, adhesión y migración de leucocitos en el compartimento tisular extravascular en un solo sistema 14,16,17,21,26.
Cabe señalar que incluso cuando el caudal en la entrada de bMFA es fijo, las condiciones de flujo en la red varían en diferentes ubicaciones y no se pueden calcular mediante una fórmula matemática simple. Se desarrolló un modelo basado en dinámica de fluidos computacional (CFD) para calcular diferentes parámetros de flujo (por ejemplo, tensión de cizallamiento, velocidad de cizallamiento, velocidad) en diferentes ubicaciones de la red. Este modelo CFD se utilizó para simular los patrones de perfusión de tinte y los parámetros de flujo en el bMFA. La validación cruzada con resultados experimentales sugirió que las resistencias de flujo a través de la red están bien predichas por el modelo computacional (Figura 3)17. Este modelo CFD se utilizó para estimar la velocidad y el perfil de la velocidad de cizallamiento en cada recipiente de bMFA (Figura 4), lo que permitió analizar los efectos del flujo de cizallamiento y la geometría en el laminado, la adhesión y la migración de leucocitos16. Los leucocitos se adhieren preferentemente cerca de bifurcaciones y en regiones de bajo cizallamiento in vivo, y estos patrones espaciales de adhesión leucocitaria se demostraron con éxito en bMFA utilizando neutrófilos (Figura 5)16. Este artículo describe el protocolo para preparar bMFA para estudiar la interacción leucocitario-endotelial en condiciones inflamatorias utilizando células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) y neutrófilos humanos. Los sistemas microfisiológicos, como el bMFA, se pueden utilizar para estudiar las interacciones de las células endoteliales con diferentes tipos de células como neutrófilos, monocitos, linfocitos y células tumorales 18,27,28,29,30. El bMFA se puede sembrar con células endoteliales primarias de diferentes órganos (por ejemplo, pulmón vs. cerebro) y diferentes especies (por ejemplo, células endoteliales humanas vs. murinas), así como líneas celulares endoteliales 21,27,31,32. El bMFA se puede utilizar para estudiar múltiples respuestas celulares, interacciones célula-célula, función de barrera, administración de fármacos y toxicidad de fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El bMFA reproduce la topografía y las condiciones de flujo de las redes microvasculares in vivo y se puede utilizar para estudiar la interacción leucocito-célula endotelial y la función endotelial in vitro en condiciones fisiológicamente realistas. En la microvasculatura de ratón o humano, la geometría de las redes microvasculares es autosimilar y fractal, y el número de Reynolds << 1, lo que indica que la geometría vascular no afecta significativamente los patrones de flujo. Por lo tanto, la b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, Número de subvención: GM114359 y GM134701 (M.F.K. y L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), y la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa, Número de subvención: HDTRA11910012 (M.F.K. y L.E.K.).
Materials
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
