शास्त्रीय साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस की सीमाओं को दूर करने के लिए, विशिष्ट संशोधनों के साथ प्रोलाइन एनालॉग्स को कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन में शामिल किया गया था। हम दिखाते हैं कि फ्लोरीन द्वारा हाइड्रोजन का प्रतिस्थापन या प्रोलाइन अवशेषों (“आणविक सर्जरी”) में डबल बॉन्ड द्वारा एकल का प्रतिस्थापन मौलिक प्रोटीन गुणों को कैसे प्रभावित करता है, जिसमें प्रकाश के साथ उनकी तह और बातचीत शामिल है।
शेष 19 विहित अमीनो एसिड में से किसी एक द्वारा पारंपरिक साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा प्रोटीन में प्रोलाइन (प्रो) अवशेषों का प्रतिस्थापन अक्सर प्रोटीन तह के लिए हानिकारक होता है और विशेष रूप से, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और संबंधित वेरिएंट में क्रोमोफोर परिपक्वता। एक उचित विकल्प प्रोटीन के अनुवाद में हेरफेर करना है ताकि सभी प्रो अवशेषों को अवशेषों को विशेष रूप से एनालॉग्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सके, एक विधि जिसे चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) के रूप में जाना जाता है। अंतर्निहित रासायनिक संशोधनों का उपयोग एक प्रकार की “आणविक सर्जरी” के रूप में किया जा सकता है ताकि औसत दर्जे के परिवर्तनों को बारीकी से विच्छेदित किया जा सके या यहां तक कि तर्कसंगत रूप से विभिन्न प्रोटीन गुणों में हेरफेर किया जा सके। यहां, अध्ययन अपने अनुक्रम में 10-15 प्रोलाइनों के साथ हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के वर्णक्रमीय वेरिएंट के विशिष्ट β-बैरल संरचना के संगठन में प्रोलाइन्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एसपीआई विधि की उपयोगिता को दर्शाता है: बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी), NowGFP, और KillerOrange। प्रो अवशेष व्यक्तिगत β-स्ट्रैंड के बीच वर्गों को जोड़ने में मौजूद होते हैं और बैरल पाड़ के समापन ढक्कन का गठन करते हैं, इस प्रकार पानी से क्रोमोफोर के इन्सुलेशन के लिए जिम्मेदार होते हैं, यानी, प्रतिदीप्ति गुण। (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4 S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), और 3,4-dehydroproline (Dhp) के साथ चयनात्मक दबाव निगमन प्रयोगों को अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में एक proline-auxotrophic E. coli तनाव का उपयोग करके किया गया था। हमने पाया कि एस-एफएलपी और डीएचपी के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन सक्रिय हैं (यानी, फ्लोरोसेंट), जबकि अन्य दो एनालॉग्स (डीएफपी और आर-एफएलपी) ने बेकार, मिसफोल्डेड प्रोटीन का उत्पादन किया। यूवी-विस अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रोफाइल के निरीक्षण ने प्रो एनालॉग्स वाले प्रोटीन में कुछ विशिष्ट परिवर्तन दिखाए। ईजीएफपी वेरिएंट में तह गतिज प्रोफाइल की परीक्षा ने एस-एफएलपी की उपस्थिति में एक त्वरित रीफोल्डिंग प्रक्रिया दिखाई, जबकि प्रक्रिया डीएचपी युक्त प्रोटीन में जंगली-प्रकार के समान थी। यह अध्ययन परमाणु स्तर (“आणविक सर्जरी”) पर प्रोटीन अवशेषों के सूक्ष्म संशोधनों का उत्पादन करने के लिए एसपीआई विधि की क्षमता को दर्शाता है, जिसे ब्याज के अन्य प्रोटीनों के अध्ययन के लिए अपनाया जा सकता है। यह β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वर्ग में तह और स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुणों पर करीबी रासायनिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन के परिणामों को दर्शाता है।
शास्त्रीय साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस डीएनए स्तर पर कोडोन हेरफेर द्वारा किसी भी मौजूदा जीन-एन्कोडेड प्रोटीन अनुक्रम के क्रमपरिवर्तन की अनुमति देता है। प्रोटीन तह और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए, समान समकक्षों के साथ समान अमीनो एसिड को बदलना अक्सर वांछनीय होता है। हालांकि, पारंपरिक प्रोटीन म्यूटाजेनेसिस निश्चित रूप से सेरोनिकल अमीनो एसिड जैसे सेर / अला / साइस, थ्र / वैल, ग्लू / जीएलएन, एएसपी / एएसएन, टायर / पीएचई के बीच संरचनात्मक रूप से समान प्रतिस्थापन तक सीमित है, जो मानक आनुवंशिक कोड प्रदर्शनों की सूची में मौजूद हैं। दूसरी ओर, अन्य विहित अमीनो एसिड जैसे कि टीआरपी, मेट, हिज, या प्रो के लिए ऐसी कोई संभावना नहीं है, जो अक्सर प्रोटीन में आवश्यक संरचनात्मक और कार्यात्मक भूमिका निभातेहैं। प्रोटीन की अत्यधिक विशिष्ट आंतरिक वास्तुकला और उनकी तह प्रक्रिया के संदर्भ में इन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण गैर-विघटनकारी आइसोस्टेरिक संशोधनों को उत्पन्न करना है। दरअसल, जब इन विहित अमीनो एसिड के आइसोस्टेरिक अमीनो एसिड एनालॉग्स, जिन्हें गैर-विहित अमीनो एसिड (एनसीएए) के रूप में भी जाना जाता है, को प्रोटीन में डाला जाता है, तो वे एकल परमाणुओं या परमाणु समूहों जैसे एच / एफ, सीएच 2 / एस / से /टे के स्तर पर भी सूक्ष्म परिवर्तनों की अनुमति देते हैं, जिसे “परमाणु उत्परिवर्तन” के रूप में जाना जाता है। इस तरह के “आणविक सर्जरी” परिवर्तित प्रोटीन का उत्पादन करते हैं जिनके गुण पूरी तरह से एकल परमाणुओं या परमाणुओं के समूहों के आदान-प्रदान से होते हैं, जो अनुकूल मामलों में विश्लेषण किया जा सकता है, और पता लगाए गए परिवर्तनों को तर्कसंगत बनाया जा सकता है। इस तरह, प्रोटीन तह और संरचना का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन संश्लेषण का दायरा शास्त्रीय डीएनए म्यूटाजेनेसिस से परे तक बढ़ाया गया है। ध्यान दें कि साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा उत्पन्न प्रोटीन को आमतौर पर “म्यूटेंट” के रूप में संदर्भित किया जाता है, जबकि प्रतिस्थापित विहित अमीनो एसिड वाले प्रोटीन को “वेरिएंट” 3, “एलोप्रोटीन” 4, या “प्रोटीन कॉन्जेनर्स” 5 के रूप में संदर्भित किया जाता है।
ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), जिसे पहली बार समुद्री जीव एक्गोरिया विक्टोरिया में पहचाना गया था, पराबैंगनी-से-नीले प्रकाश 6,7 के संपर्क में आने पर उज्ज्वल हरे रंग की प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है। आज, जीएफपी का उपयोग आमतौर पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण के नियमित दृश्य के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील लेबलिंग उपकरण के रूप में किया जाता है। जीएफपी विभिन्न बायोफिजिकल 8,9,10 और बायोमेडिकल 11,12 अध्ययनों के साथ-साथ प्रोटीन इंजीनियरिंग 13,14,15 में भी उपयोगी साबित हुआ है। जीएफपी संरचना के कठोर विश्लेषण ने विभिन्न स्थिरता और प्रतिदीप्ति मैक्सिमा16,17 की विशेषता वाले कई रूपों के निर्माण को सक्षम किया। सेल और आणविक जीव विज्ञान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश जीएफपी वेरिएंट समाधान और क्रिस्टल18 दोनों में मोनोमेरिक प्रोटीन हैं। उनका प्रमुख संरचनात्मक संगठन जीएफपी परिवार के सभी सदस्यों के लिए विशिष्ट है, जो उनके फाइलोजेनेटिक मूल से स्वतंत्र है, और इसमें 11 β-स्ट्रैंड होते हैं जो तथाकथित β-बैरल बनाते हैं, जबकि एक किंकीड α-हेलिक्स बैरल के केंद्र के माध्यम से चल रहा है और क्रोमोफोर (चित्रा 1 ए) को सहन करता है। क्रोमोफोर (चित्रा 1 बी) की ऑटोकैटेलिटिक परिपक्वता के लिए प्रोटीन के केंद्रीय स्थान पर इसके आसपास की साइड चेन की सटीक स्थिति की आवश्यकता होती है; इनमें से कई साइड चेन अन्य जीएफपी वेरिएंट19 में अत्यधिक संरक्षित हैं। जेलीफ़िश जैसे कि एक्गोरिया विक्टोरिया से अधिकांश फ्लोरोसेंट प्रोटीन में, हरे रंग के उत्सर्जक क्रोमोफोर में दो सुगंधित छल्ले होते हैं, जिनमें टायर 66 की फिनोल रिंग और इमिडाज़ोलिनोन की पांच-सदस्यीय हेटरोसाइक्लिक संरचना (चित्रा 1 बी) शामिल हैं। क्रोमोफोर, जब प्रोटीन मैट्रिक्स में ठीक से एम्बेडेड होता है, तो पूरे प्रोटीन की विशेषता प्रतिदीप्ति के लिए जिम्मेदार होता है। यह संरचना के केंद्र में स्थित है, जबकि बैरल संरचना इसे जलीय माध्यम20 से इन्सुलेट करती है। थोक पानी के लिए क्रोमोफोर के संपर्क में आने से प्रतिदीप्ति शमन होगा, यानी, प्रतिदीप्ति21 का नुकसान।
बैरल जैसी संरचना की उचित तह प्रतिदीप्ति शमन22 के खिलाफ क्रोमोफोर की रक्षा के लिए आवश्यक है। प्रोलाइन (प्रो) अवशेष जीएफपी23 के संरचनात्मक संगठन में एक विशेष भूमिका निभाते हैं। एक β-स्ट्रैंड का समर्थन करने में असमर्थ होने के कारण, वे प्रोटीन संरचना को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार छोरों को जोड़ने का गठन करते हैं। आश्चर्य की बात नहीं है, 10-15 प्रोलाइन अवशेष Aequorea– और Anthoathecata-व्युत्पन्न GFPs दोनों में पाए जाते हैं; उनमें से कुछ फ्लोरोसेंट β-बैरल प्रोटीन के अन्य प्रकारों में अत्यधिक संरक्षित हैं। प्रोलाइन्स से उनकी अजीब ज्यामितीय विशेषताओं के कारण तह गुणों को गंभीर रूप से प्रभावित करने की उम्मीद की जाती है। उदाहरण के लिए, Aequorea-व्युत्पन्न GFPs में, दस प्रोलाइन अवशेषों (चित्रा 2A) में से, नौ रूप ट्रांस– और केवल एक सीआईएस-पेप्टाइड बॉन्ड (Pro89) बनाता है। Pro58 आवश्यक है, यानी, 19 विहित अमीनो एसिड के बाकी हिस्सों के साथ विनिमेय नहीं है। यह अवशेष Trp57 अवशेषों की सही स्थिति के लिए जिम्मेदार हो सकता है, जिसे क्रोमोफोर परिपक्वता और समग्र GFP तह24 के लिए महत्वपूर्ण बताया गया है। तीन प्रोलाइन अवशेषों (Pro54, Pro56, Pro58) और Trp57 के साथ टुकड़ा PVPWP चित्रा 1A से GFP संरचना में “निचले ढक्कन” का आवश्यक हिस्सा है। PVPWP संरचनात्मक आकृति कई प्रोटीनों जैसे साइटोक्रोम और यूकेरियोटिक वोल्टेज-सक्रिय पोटेशियमचैनलों में पाई जाती है। 75 और 89 पदों पर प्रोलाइन-टू-अलैनिन प्रतिस्थापन भी प्रोटीन अभिव्यक्ति और तह के लिए हानिकारक हैं और क्रोमोफोर परिपक्वता को समाप्त करते हैं। Pro75 और Pro89 क्रोमोफोर (चित्रा 1A) को दफन करने वाले “ऊपरी ढक्कन” का हिस्सा हैं और 11-फंसे हुए β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन23 में संरक्षित हैं। ये दो “ढक्कन” क्रोमोफोर को जलीय विलायक से बाहर रखा जाता है, भले ही स्थिर तृतीयक संरचना आंशिक रूपसे टूट गई हो। इस तरह की एक विशिष्ट आणविक वास्तुकला फ्लोरोफोर को टकराव (गतिशील) प्रतिदीप्ति शमन से बचाती है, उदाहरण के लिए, पानी, ऑक्सीजन, या अन्य अलग-अलग लिगेंड द्वारा।
जीएफपी संरचना के आणविक इंजीनियरिंग करने के लिए, किसी को प्रोटीन की प्राथमिक संरचना में अमीनो एसिड प्रतिस्थापन पेश करना चाहिए। जीएफपी पर कई उत्परिवर्तन किए गए हैं, जो उन्नत स्थिरता, तेज और विश्वसनीय तह, और चर प्रतिदीप्ति गुणों के साथ वेरिएंट प्रदान करतेहैं। फिर भी, ज्यादातर मामलों में, प्रोलाइन अवशेषों के उत्परिवर्तन को इस तथ्य के कारण एक जोखिम भरा दृष्टिकोण माना जाता है कि शेष 19 विहित अमीनो एसिड में से कोई भी प्रोलाइन अवशेष27 के संरचनात्मक प्रोफ़ाइल को ठीक से बहाल नहीं कर सकता है। इस प्रकार, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जिसमें प्रोलाइन अवशेषों को अन्य प्रोलाइन-आधारित संरचनाओं के साथ बदल दिया जाता है, जिसे प्रोलाइन एनालॉग्स28 के रूप में डब किया जाता है। अपनी अद्वितीय चक्रीय रासायनिक संरचना के कारण, प्रोलाइन दो विशेषता संरचनात्मक संक्रमण (चित्रा 1 सी) प्रदर्शित करता है: 1) प्रोलाइन रिंग प्यूकरिंग, रीढ़ की हड्डी के संगठन को शामिल करने वाली एक तेज प्रक्रिया, जो मुख्य रूप से मरोड़ कोण φ को प्रभावित करती है, और 2) पेप्टाइड बॉन्ड सीआईएस / ट्रांस आइसोमेराइजेशन, एक धीमी प्रक्रिया जो ω मरोड़ कोणों के माध्यम से रीढ़ की हड्डी तह को प्रभावित करती है। अपनी धीमी प्रकृति के कारण, बाद का संक्रमण आमतौर पर पूरे प्रोटीन की तह प्रक्रिया में दर-सीमित चरणों के लिए जिम्मेदार होता है। यह पहले दिखाया गया है कि पेप्टाइड बॉन्ड सीआईएस / ट्रांस आइसोमेराइजेशन कुछ प्रोलाइन अवशेषों के आसपास जीएफपी वेरिएंट की तह में धीमी गति से कदम उठाता है। उदाहरण के लिए, Pro89 पर सीआईएस-पेप्टाइड बॉन्ड के गठन में तह की प्रक्रिया में धीमा कदम है क्योंकि यह ट्रांस से सीआईएस29 तक बॉन्ड संक्रमण पर निर्भर करता है। Pro89 को ऑल-ट्रांस पेप्टाइड लूप के साथ बदलने के बाद एक तेज़ रीफ़ोल्डिंग प्राप्त की जा सकती है, यानी, एक सीआईएस-टू-ट्रांस आइसोमेराइजेशन इवेंट30 को समाप्त करके। सीआईएस / ट्रांस आइसोमेराइजेशन के अलावा, पुकर संक्रमण भी बैकबोन संगठन और प्रोटीन इंटीरियर27,31 के भीतर पैकिंग के कारण प्रोटीन तह में गहरा परिवर्तन उत्पन्न कर सकते हैं।
रासायनिक संशोधनों के परिणामस्वरूप प्रोलाइन अवशेषों के आंतरिक संरचनात्मक संक्रमणों में परिवर्तन होता है, जिससे प्रोटीन की गुना करने की क्षमता प्रभावित होती है। कुछ प्रोलाइन एनालॉग्स प्रोटीन में प्रोलाइन प्रतिस्थापन के लिए विशेष रूप से आकर्षक उम्मीदवार हैं क्योंकि वे तह गुणों के हेरफेर और अध्ययन की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), और 3,4-dehydroproline (Dhp) चार एनालॉग (चित्रा 1D) हैं जो आणविक आयतन और ध्रुवीयता32 दोनों के संदर्भ में प्रोलाइन से न्यूनतम रूप से भिन्न होते हैं। उसी समय, प्रत्येक एनालॉग एक अलग रिंग पुकरिंग प्रदर्शित करता है: एस-एफएलपी सी4-एंडो पुकर को स्थिर करता है, आर-एफएलपी सी4-एक्सो पुकर को स्थिर करता है, डीएफपी कोई स्पष्ट प्यूकर वरीयता प्रदर्शित नहीं करता है, जबकि डीएचपी पुकरिंग (चित्रा 1 डी) 33 को समाप्त कर देता है। प्रोटीन संरचना में इन एनालॉग्स का उपयोग करके, कोई भी प्रोलाइन अवशेषों के संरचनात्मक संक्रमण के साथ हेरफेर कर सकता है, और इसके साथ, परिणामी जीएफपी वेरिएंट के गुणों को प्रभावित करता है।
इस काम में, हम चयनात्मक दबाव निगमन विधि (एसपीआई, चित्रा 3) 34 का उपयोग करके जीएफपी वेरिएंट की संरचना में प्रोलाइन एनालॉग्स (चित्रा 1 डी) के नामित सेट को शामिल करने के लिए तैयार हैं। उनके निकटतम isostructural analogs के साथ अमीनो एसिड अवशेषों का प्रतिस्थापन प्रोटीन डिजाइन35,36 में एक लागू biotechnological अवधारणा है। इस प्रकार, एक मॉडल प्रोटीन में प्रोलाइन एनालॉग्स के प्रभाव प्रोटीन इंजीनियरिंग37 में उपकरण के रूप में सेवा करने की उनकी क्षमता को दर्शाते हैं। वांछित एनालॉग्स वाले प्रोटीन का उत्पादन संशोधित ई कोलाई उपभेदों में किया गया था जो प्रोलाइन (प्रोलाइन-ऑक्सोट्रॉफी) का उत्पादन करने में सक्षम नहीं हैं। इस प्रकार, उन्हें प्रोटीन जैवसंश्लेषण38 की प्रक्रिया में सब्सट्रेट के प्रतिस्थापन को स्वीकार करने के लिए मजबूर किया जा सकता है। प्रोलाइन का यह वैश्विक प्रतिस्थापन अंतर्जात aminoacyl-tRNA सिंथेटेस39 के प्राकृतिक सब्सट्रेट लचीलेपन द्वारा सक्षम है, महत्वपूर्ण एंजाइम उपयुक्त अमीनो एसिड40 के साथ tRNA के esterification को उत्प्रेरित करते हैं। सामान्य तौर पर, जैसा कि चित्रा 3 में उल्लिखित है, सेलुलर विकास एक परिभाषित माध्यम में किया जाता है जब तक कि मध्य-लॉगरिदमिक विकास चरण तक नहीं पहुंच जाता है। अगले चरण में, प्रतिस्थापित किए जाने वाले अमीनो एसिड को किण्वन के दौरान अभिव्यक्ति प्रणाली से इंट्रासेल्युलर रूप से समाप्त कर दिया जाता है और बाद में वांछित एनालॉग या एनसीएए द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति तब अवशेष-विशिष्ट गैर-विहित अमीनो एसिड निगमन के लिए प्रेरित होती है। इसके एनालॉग के साथ संज्ञानात्मक अमीनो एसिड का प्रतिस्थापन एक proteome-व्यापक तरीके से होता है। यद्यपि इस दुष्प्रभाव का मेजबान तनाव के विकास पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है, लक्ष्य प्रोटीन उत्पादन की गुणवत्ता ज्यादातर प्रभावित नहीं होती है, क्योंकि पुनः संयोजक अभिव्यक्ति में, सेलुलर संसाधनों को मुख्य रूप से लक्ष्य प्रोटीन41,42 के उत्पादन के लिए निर्देशित किया जाता है। इसलिए, एक कसकर विनियमित, inducible अभिव्यक्ति प्रणाली और मजबूत प्रमोटर उच्च निगमन दक्षता43 के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमारा दृष्टिकोण कई अवशेषों पर आधारित है- कोडोन (सेंस कोडोन रीअसाइनमेंट) के जवाब में एनसीएए के विशिष्ट निगमन, जिससे लक्ष्य जीन के भीतर, प्रो एनालॉग सम्मिलन के लिए पदों की संख्या को साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस44 के माध्यम से हेरफेर किया जा सकता है। रोगाणुरोधी गुणों के साथ पुनः संयोजक पेप्टाइड्स की तैयारी पर हमारी पिछली रिपोर्ट में एक समान दृष्टिकोण लागू किया गया था45। इस काम में, हमने एसपीआई विधि को लागू किया है, जो सभी प्रोलाइन अवशेषों को संबंधित एनालॉग्स द्वारा प्रतिस्थापित करने की अनुमति देता है, ताकि विहित अमीनो एसिड प्रदर्शनों की सूची के साथ संश्लेषित प्रोटीन में मौजूद प्रोटीन में मौजूद नहीं होने वाले विशिष्ट भौतिक-रासायनिक गुणों के पास प्रोटीन उत्पन्न करने की उम्मीद की जा सके। परिणामी वेरिएंट के तह और प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल की विशेषता से, हम जीएफपी के रूपों में परमाणु प्रतिस्थापन के प्रभावों को प्रदर्शित करने का लक्ष्य रखते हैं।
प्रकृति में, प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों के साथ जोड़तोड़ आमतौर पर उत्परिवर्तन के कारण होते हैं, यह घटना जो प्रोटीन अनुक्रम में कुछ पदों पर एक अमीनो एसिड पहचान के आदान-प्रदान की ओर ले जाती है। इस प्राकृतिक तंत्र को व्यापक रूप से म्यूटाजेनेसिस के रूप में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए एक जैव-तकनीकी विधि के रूप में लागू किया जाता है, और यह प्रक्रिया में शामिल 20 विहित अमीनो एसिड के प्रदर्शनों की सूची पर निर्भर करता है। हालांकि, प्रोलाइन अवशेषों का आदान-प्रदान समस्याग्रस्त है। अपने विशेष बैकबोन समूह वास्तुकला के कारण, यह प्रतिस्थापन72 के लिए शेष 19 अवशेषों के साथ शायद ही विनिमेय है। उदाहरण के लिए, प्रोलाइन को आमतौर पर पॉलीपेप्टाइड अनुक्रमों में एक माध्यमिक संरचना ब्रेकर के रूप में जाना जाता है क्योंकि सबसे आम माध्यमिक संरचनाओं के साथ इसकी खराब संगतता, यानी, α-हेलिक्स और β-स्ट्रैंड। यह प्रोलाइन सुविधा आसानी से खो जाती है जब अवशेषों को आम प्रदर्शनों की सूची से एक और अमीनो एसिड में उत्परिवर्तित किया जाता है। इसके रासायनिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन का प्रतिस्थापन एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो अपने विशिष्ट संरचनात्मक संक्रमणों पर पूर्वाग्रह लागू करते हुए या आणविक मात्रा और ध्रुवीयता के मॉडुलन का उत्पादन करते हुए माता-पिता प्रोलाइन अवशेषों की मूल रीढ़ की हड्डी की विशेषताओं को बनाए रखने में सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, हाइड्रॉक्सी-, फ्लोरो-, एल्काइल-, डिहाइड्रोप्रोलाइन्स, चर अंगूठी आकार और अधिक वाली संरचनाओं जैसे एनालॉग संरचनाओं के साथ जीवाणु संस्कृतियों की आपूर्ति करना संभव है, इस प्रकार विशिष्ट प्रोलाइन अवशेष परिवर्तनों वाले प्रोटीन के उत्पादन की सुविधा प्रदान करता है।
इस अध्ययन में वर्णित चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) विधि एक वैश्विक, यानी, संबंधित रासायनिक एनालॉग्स के साथ लक्ष्य प्रोटीन में सभी प्रोलाइनों के अवशेष-विशिष्ट प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। विधि का महत्व इस तथ्य से परिलक्षित होता है कि एसपीआई सामान्य म्यूटाजेनेसिस तकनीकों के लिए दुर्गम अनुक्रम परिवर्तन बनाने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, यह एक लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन की अनुमति देता है जिसमें छोटे संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं जो आमतौर पर एक या दो परमाणु प्रतिस्थापन / विलोपन / परिवर्धन से अधिक नहीं हो सकते हैं, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है। इस तरह के प्रोटीन संशोधनों को “परमाणु उत्परिवर्तन” 73,74 कहा जाता है। जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन में, इस आणविक घुसपैठ का परिणाम तह, स्थानीय ध्रुवीयता, प्रोटीन पैकिंग, शामिल संरचनात्मक विशेषताओं की स्थिरता के वेग में देखा जा सकता है। अवशोषण और प्रतिदीप्ति गुणों में परिवर्तन अप्रत्यक्ष रूप से प्रोटीन तह और अवशेष माइक्रोएन्वायरमेंट पर प्रभाव के कारण उत्पादित होते हैं। एसपीआई द्वारा किए गए आणविक परिवर्तनों की सटीकता आमतौर पर अन्य विहित अवशेषों के लिए प्रोलाइन के उत्परिवर्तन की तुलना में बहुत अधिक होती है, उत्तरार्द्ध आमतौर पर प्रोटीन तह, उत्पादन और अलगाव के लिए हानिकारक होता है।
एक उत्पादन विधि के रूप में, एसपीआई दृष्टिकोण देशी अमीनो एसिड के रासायनिक एनालॉग्स की ओर एमिनोएसिल-टीआरएनए सिंथेटेज पॉकेट की सब्सट्रेट सहिष्णुता का उपयोग करता है। सिंथेटेज अमीनो एसिड संरचना की सही पहचान के लिए जिम्मेदार है, जबकि प्रोटीन में निगमन अनुवाद प्रक्रिया में डाउनस्ट्रीम होता है। Instrumentally, एसपीआई में प्रोटीन उत्पादन, अलगाव, और शुद्धिकरण किसी भी अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति तकनीकों के लिए विशिष्ट तरीके से किया जाता है; हालांकि, प्रोटोकॉल में कुछ परिवर्धन के साथ निम्नानुसार: प्रोलाइन, जो प्रतिस्थापन के लिए बाध्य है, किण्वन प्रक्रिया की शुरुआत में प्रदान किया जाता है, जैसे कि कोशिकाएं बढ़ सकती हैं और अपनी बरकरार सेलुलर मशीनरी विकसित कर सकती हैं। हालांकि, कोशिका संस्कृति को अधिकतम ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंचने की अनुमति नहीं है, ताकि कोशिकाओं को लॉगरिदमिक चरण में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम रखा जा सके। इस बिंदु पर एसपीआई विधि के दो प्रमुख रूप हैं। पहले एक में, प्रोलाइन की एकाग्रता को प्रारंभिक विकास माध्यम (एक रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम) में समायोजित किया जाता है जैसे कि प्रोलाइन की कमी किसी भी बाहरी घुसपैठ के बिना होती है। कोशिकाएं लॉगरिदमिक विकास चरण से बाहर निकलने से पहले माध्यम में प्रोलाइन को समाप्त कर देती हैं, और फिर, बाद में, एनालॉग जोड़ा जाता है, और ब्याज उत्पादन का प्रोटीन प्रेरित होता है। विधि के दूसरे संस्करण में, कोशिकाओं को उनके लॉगरिदमिक चरण के मध्य तक प्रोलाइन युक्त माध्यम में उगाया जाता है। इस बिंदु पर, कोशिकाओं को बाहर निकाला जाना चाहिए और शारीरिक रूप से किसी अन्य माध्यम में स्थानांतरित किया जाना चाहिए, जिसमें अब प्रोलाइन नहीं है, केवल एनालॉग, ब्याज के प्रोटीन के बाद के प्रेरण के साथ। दोनों संस्करणों में, एनालॉग और प्रोटीन प्रेरण अभिकर्मक पूर्व-विकसित कोशिकाओं को प्रदान किए जाते हैं। जंगली-प्रकार के प्रोटीन का अलगाव और शुद्धिकरण उसी तरह से किया जाता है जैसे कि वेरिएंट के लिए। सिद्धांत रूप में, प्रत्येक उपलब्ध प्रो-ऑक्सोट्रोफिक स्ट्रेन का उपयोग अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में किया जा सकता है। फिर भी, सबसे उपयुक्त मेजबान की पहचान करने के लिए अभिव्यक्ति परीक्षण ों की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, विभिन्न रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया के परीक्षणों का उपयोग प्रोटीन उपज को अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है।
रासायनिक एनालॉग्स के बारे में कुछ आवश्यकताएं हैं जिन्हें एसपीआई के लिए विचार करने की आवश्यकता है, जैसे कि घुलनशीलता और एकाग्रता। अमीनो एसिड की चयापचय उपलब्धता और अपटेक माध्यम में भंग अणुओं की संख्या पर निर्भर करता है। किसी विशेष यौगिक की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए, थोड़ा अम्लीय या क्षारीय स्थितियों को चुना जा सकता है। चूंकि कृत्रिम अणु अपने सेल विषाक्तता के कारण विकास निरोधात्मक प्रभाव पैदा कर सकते हैं, इसलिए कोशिका तनाव से बचने के लिए एकाग्रता को कम से कम किया जाना चाहिए75।
एसपीआई की एक मामूली कमजोरी बड़ी संख्या में पदों के साथ निगमन दक्षता में कमी है जिसे आदान-प्रदान करने की आवश्यकता है। सिद्धांत रूप में, साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा लक्ष्य बायोमोलेक्यूल के भीतर अमीनो एसिड आवृत्ति में कमी इस समस्या को हल कर सकती है। हालांकि, वांछित प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण प्राथमिक संरचना को बदलने से प्रभावित हो सकते हैं।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एसपीआई विहित अमीनो एसिड के अवशेष-विशिष्ट प्रतिस्थापन की अनुमति देता है। इसका तात्पर्य यह है कि गैर-विहित अमीनो एसिड को लक्ष्य प्रोटीन के भीतर विहित अमीनो एसिड की हर स्थिति में डाला जाता है, जिसमें संरक्षित अवशेष शामिल हैं जो प्रोटीन फ़ंक्शन या तह के लिए अपरिहार्य हैं। साइट-विशिष्ट निगमन के लिए वैकल्पिक विधियाँ इस मुद्दे को दूर करने की एकमात्र संभावनाहैं। पिछले कुछ दशकों में, ऑर्थोगोनल जोड़ी विधि विकसित की गई है जो पूर्वनिर्धारित साइटों पर संशोधित अवशेषों वाले प्रोटीन का उत्पादन कर सकती है। इस विधि के सबसे आम संशोधन को स्टॉप कोडोन दमन के रूप में जाना जाता है। यह विधि सिंथेटिक अमीनो एसिड76 के साइट-विशिष्ट निगमन के लिए समर्पित एक इंजीनियर ऑर्थोगोनल अनुवाद प्रणाली पर आधारित है। विभिन्न साइड-चेन संशोधनों के साथ 200 से अधिक अमीनो एसिड को इस दृष्टिकोण77 का उपयोग करके आज तक प्रोटीन में शामिल किया गया है। हालांकि, ये अनुवाद प्रणालियां अभी भी लक्ष्य प्रोटीन में प्रोलाइन एनालॉग्स के सम्मिलन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, विधि के प्रदर्शन को मामूली अमीनो एसिड संशोधनों के मामले में कम माना जाता है क्योंकि एमिनोएसिल-टीआरएनए सिंथेटेस की कुछ पृष्ठभूमि संकीर्णता आमतौर पर इंजीनियर अनुवाद प्रणालियों में रहती है।
एसपीआई का उपयोग करके, हमने कई β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट का उत्पादन किया और इसके अप्राकृतिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन के आदान-प्रदान के परिणामों का अध्ययन किया। आर-एफएलपी और डीएफपी के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन के मामले में, अभिव्यक्ति मेजबान द्वारा एक बेकार प्रोटीन का उत्पादन किया गया था। प्रभाव संभवतः प्रोटीन misfolding द्वारा उत्पादित किया जाता है। उत्तरार्द्ध आर-एफएलपी द्वारा प्रचारित सी 4-एक्सो संरचना से उत्पन्न हो सकता है, जो मूल प्रोटीन संरचनाओं27 द्वारा प्रतिकूल है। Dfp के साथ, misfolding प्रोलाइन अवशेष27 पर ट्रांस-टू-सीआईएस पेप्टाइड बॉन्ड आइसोमेराइजेशन के कम वेग से उत्पादित होने की संभावना है। उत्तरार्द्ध को प्रोटीन तह के गतिज प्रोफ़ाइल में सीमित चरणों में से एक माना जाता है जो β-बैरल गठन और बाद में क्रोमोफोर परिपक्वता को प्रभावित करता है। दरअसल, दोनों अमीनो एसिड, आर-एफएलपी और डीएफपी के लिए, प्रोटीन उत्पादन के परिणामस्वरूप एक एकत्रित और अघुलनशील प्रोटीन हुआ। नतीजतन, क्रोमोफोर गठन नहीं हो सका, और प्रतिदीप्ति पूरी तरह से खो गई थी। एस-एफएलपी और डीएचपी के साथ, हालांकि, उचित प्रोटीन परिपक्वता देखी गई थी, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक एनालॉग / प्रोटीन संयोजन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन नमूने थे। प्रोटीन के अवशोषण और प्रतिदीप्ति विशेषताओं में कुछ मॉडुलन के बावजूद, ये काफी हद तक जंगली-प्रकार के प्रोटीन के समान बने रहे। एमिनो एसिड प्रतिस्थापन का प्रभाव refolding कैनेटीक्स अध्ययन में पता चला था। उत्तरार्द्ध ने S-Flp के साथ प्रतिस्थापन के मामले में तेजी से refolding दिखाया। मॉडल अध्ययनों से पता चला है कि यह अवशेष ट्रांस-टू-सीआईएस एमाइड रोटेशन वेग में कुछ सुधार उत्पन्न कर सकता है और सी 4-एंडो संरचना के गठन का कारण बन सकता है। इन दोनों कारकों के ईजीएफपी में इस अवशेषों के लाभकारी गतिज प्रभावों में योगदान करने की संभावना है। इसके विपरीत, डीएचपी ने मूल प्रोटीन के समान अधिकतम गतिज तह प्रोफाइल का उत्पादन किया। जांच किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन में केवल परमाणु उत्परिवर्तन द्वारा उत्पादित परिणामों की विविधता लक्ष्य प्रोटीन गुणों को बदलने में एसपीआई उत्पादन विधि की क्षमता को दर्शाती है। एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन द्वारा प्रेरित प्रोटीन परिवर्तनों का एंजाइमों78,79,80 और आयन चैनलों81,82 की इंजीनियरिंग में और अधिक प्रभाव पड़ता है, साथ ही साथ प्रोटीन स्थिरता के सामान्य इंजीनियरिंग में भी।
एसपीआई विधि की मूल सीमा प्रोलाइन के आदान-प्रदान में इसकी “सभी-या-कोई नहीं” मोड संबंधित एनालॉग्स के साथ रहती है। यह ठीक से चयन करने में सक्षम होने के लिए बहुत फायदेमंद होगा, जो प्रोलाइन अवशेषों को एनालॉग्स के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, और कौन से लोगों को असंशोधित रहना चाहिए। हालांकि, वर्तमान में, ऐसी कोई तकनीक नहीं है जो माइक्रोबियल उत्पादन मेजबान का उपयोग करके इस तरह के परिष्कृत उत्पादन का प्रदर्शन कर सके। प्रोटीन का रासायनिक संश्लेषण83,84, साथ ही साथ सेल-मुक्त उत्पादन85,86, दो वैकल्पिक तरीके हैं जो स्थिति-विशिष्ट प्रोलाइन संशोधनों का उत्पादन कर सकते हैं। फिर भी, उनकी परिचालन जटिलता और कम उत्पादन पैदावार उन्हें जीवित कोशिकाओं में उत्पादन की तुलना में कम बनाती है। अब तक, एसपीआई परमाणु उत्परिवर्तन वाले जटिल प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे अधिक परिचालन रूप से सरल और मजबूत दृष्टिकोण बना हुआ है। अप्राकृतिक अमीनो एसिड विकल्प पेश करके, विधि एक लक्षित तरीके से प्रोटीन सुविधाओं को संशोधित करने की अनुमति देती है, जैसा कि प्रोलाइन प्रतिस्थापन द्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तह और प्रकाश अवशोषण / उत्सर्जन में परिवर्तन द्वारा यहां उदाहरण दिया गया है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (उत्कृष्टता का क्लस्टर “उत्प्रेरण में एकीकृत प्रणाली) द्वारा टीएफ और एनबी और संघीय शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय (बीएमबीएफ कार्यक्रम “एचएसपी 2020”, टीयू-डब्ल्यूएमआईएमआईपीस प्रोजेक्ट सिंटीयूबायो) द्वारा एफ-जेएस के लिए समर्थित किया गया था। और T.M.T.T.
Acetonitrile | VWR | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) | Carl Roth | 3029.1 | |
Agar-agar | Carl Roth | 5210 | |
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) | Sigma-Aldrich | 277908 | |
Ammonium peroxydisulphate (APS) | Carl Roth | 9592.2 | ≥98 %, p.a., ACS grade required |
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Carl Roth | K029 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Coomassie Brillant Blue R 250 | Carl Roth | 3862 | |
Copper sulfate (CuSO4) | Carl Roth | CP86.1 | |
D-glucose | Carl Roth | 6780 | |
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | ≥99 %, p.a., for electrophoresis |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Carl Roth | P749.1 | |
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carl Roth | X987 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) | Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) | 10731181 | cation exchange resin |
Ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
Formic acid | VWR | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
Glacial acetic acid | Carl Roth | 3738.5 | 100 %, p. a. |
Glycerol | Carl Roth | 3783 | |
Imidazole | Carl Roth | X998 | |
Hydrogen chlroide (HCl) | Merck | 295426 | |
Iron(II) chloride (FeCl2) | Sigma-Aldrich | 380024 | |
Isopropanol | Carl Roth | AE73.1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Carl Roth | KK36.1 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth | 8283.2 | |
Manganese chloride (MnCl2) | Sigma-Aldrich | 63535 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.3 | |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | |
Potassium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.3 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
RNase A | Carl Roth | 7156 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | P029 | |
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth | T879 | |
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) | Carl Roth | 0183 | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich | 857645 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) | Carl Roth | 5429 | |
Tryptone | Carl Roth | 8952 | |
Yeast extract | Carl Roth | 2363 | |
Zinc chloride (ZnCl2) | Sigma-Aldrich | 229997 | |
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A8381 | |
L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | A0884 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2128 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
L-glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
L-histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
(4S)-fluoroproline | Bachem | 4033274 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression. |
(4R)-fluoroproline | Bachem | 4033275 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression |
3,4-dehydroproline | Bachem | 4003545 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression |
4,4-difluoroproline | Enamine | EN400-17448 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression |
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 | Spectrum Medical Industries | Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198 | |
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA | GE Healthcare | HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01 | |
Luer-Lock syringe, 5 mL | Carl Roth | EP96.1 | |
Luer-Lock syringe, 20 mL | Carl Roth | T550.1 | |
Luer-Lock syringe, 50 mL | Carl Roth | T552.1 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth | TA19 | |
pQE-80L plasmid vector | Qiagen | no longer available | replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915 |
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 | Addgene | 50348 | https://www.addgene.org/50348/ |
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 | ATCC | 35607 | |
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL | Fisher Scientific | Corning Falcon, 14-959-1B | |
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Carl Roth | CCY1.1 | |
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS | Sigma-Aldrich | Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm | with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa |
HPLC autosampler vials 1.5 mL | Sigma-Aldrich | Supelco 854165 | |
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF | |
Mass spectrometry data analysis software | Agilent | MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00 | |
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 5427 R | |
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | 5810 R | |
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system | GE Healthcare | ÄKTA pure 25 L | |
Fluorescence spectrometer | Perkin Elmer | LS 55 | |
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption | Microfluidics | LM series with “Z” type chamber | |
Orbital shaker for bacterial cultivation | Infors HT | Minitron | |
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) | GE Healthcare | P-1 | |
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption | Omnilab | Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 | with MS72 sonifier tip |
UV-Vis spectrophotometer | Biochrom | ULTROSPEC 2100 | |
UV-Vis/NIR spectrophotometer | Perkin Elmer | LAMBDA 950 UV/Vis/NIR |