Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW’nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.
Meme bezinin dallanmış yapısı oldukça dinamiktir ve doğumdan sonra birkaç büyüme ve yeniden yapılanma aşamasına uğrar. İntravital mikroskopi, cilt flebi cerrahisi veya görüntüleme pencerelerinin implantasyonu ile kombinasyon halinde, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı meme bezinin dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır. Çoğu meme görüntüleme teknolojisi, saatler ila günler arasında bir zaman dilimi ile sınırlıdır, oysa meme bezi yeniden şekillendirme süreçlerinin çoğu, günlerden haftalara kadar olan zaman dilimlerinde gerçekleşir. Meme bezinin yeniden şekillenmesini incelemek için, uzun zaman dilimleri için ilgilenilen dokuya optik erişime izin veren yöntemler gereklidir. Burada, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) titanyum meme görüntüleme penceresinin, meme bezinin birkaç haftaya kadar hücresel çözünürlükte yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan geliştirilmiş bir versiyonu açıklanmaktadır. Önemli olarak, R.MIW, intravital görüntüleme deneyinin tüm süresi boyunca doku erişimi sağlar ve bu nedenle lokal doku manipülasyonu, etiketleme, ilaç uygulaması veya görüntü rehberliğinde mikrodiseksiyon için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, R.MIW, meme bezi gelişimi, homeostaz ve hastalık sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu sağlar.
Meme epiteli, memelilerde bulunan ve yavruları beslemek için süt üreten ve salgılayan eşsiz bir salgı organıdır. Yaşam boyunca, meme bezi, dokunun yapısal ve fonksiyonel değişikliklerinin eşlik ettiği çok sayıda gelişim ve büyüme turuna uğrar1. Gelişim aşamasına bağlı olarak, doku yeniden şekillenmesine katkıda bulunan hücre tipleri ve duktal ağaç içindeki konumu farklıdır.
Multifoton intravital mikroskopi (IVM), meme hücre dinamiklerinin in vivo olarak doğal ve minimal olarak bozulmuş 2,3,4 ayarında incelenmesine izin verir. Meme bezine görsel erişim sağlamak için, meme bezi gelişiminin farklı aşamalarında, ergenlik 4,5,6,7, yetişkinlik 2,8, laktasyon9,10,11,12 ve tümör dinamiği 13,14 dahil olmak üzere birkaç geçici ex vivo veya cilt flebi görüntüleme tekniği yayınlanmıştır. ,15. Bu teknikler meme hücre dinamiklerinin yüksek uzamsal ve zamansal olarak çözülmüş görüntülenmesine neden olsa da, zaman dilimi saatlerle sınırlıdır, oysa çoğu meme bezi yeniden şekillenme süreci günlerden haftalara kadar sürer. Bu nedenle, uzun zaman dilimleri için ilgilenilen dokuya optik erişime izin veren yöntemler gereklidir. Yıllar geçtikçe, bir titanyum meme görüntüleme penceresi (MIW) 2,3,19 dahil olmak üzere meme tümörü görüntüleme15,16,17,18 için birkaç kalıcı görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Meme tümörü büyümesini incelemek için çok yararlı olmasına rağmen, sağlıklı meme bezi yapısının görselleştirilmesi birkaç gün ile sınırlı kalmıştır. Son zamanlarda, pubertal meme bezinin20. haftada birkaç kez görselleştirilmesini sağlayan esnek bir silikon görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Bununla birlikte, meme bezi adiposit bakımından zengin bir yağ yastığına gömülüdür, bu da geniş ışık saçılmasına ve sonuç olarak meme duktal yapılarının sınırlı görünürlüğüne yol açar. Bu nedenle, meme bezinde uzun süre boyunca doku dinamiklerini görselleştirmek için her zaman üstün görüntüleme koşulları gereklidir. Ne klasik MIW ne de esnek silikon pencere, görüntüleme öncesi doku manipülasyonuna veya fiziksel doku konumunun optimizasyonuna izin vermez, çünkü pencere ameliyat ve implantasyondan sonra kapalı bir sistem oluşturur. Sonuç olarak, altta yatan meme dokusuna optimal optik erişimin daha uzun süreler boyunca engellenmesi muhtemeldir. Buna karşılık, cilt flebi tekniği, görüntüleme seansı sırasında dokunun optimizasyonuna ve yeniden konumlandırılmasına izin verir ve bir cilt flebi birden çok kez tekrarlanabilir2. Bununla birlikte, bir cilt flebi aracılığıyla tekrarlanan görüntüleme seansları, yalnızca cildin iyileşmesine izin vermek için ameliyatlar arasında yeterli zaman (en az 7 gün) ayrıldığında mümkündür ve bu nedenle çoğunlukla daha uzun zaman ölçeklerinde süreçleri incelemek için uygundur. Ayrıca, invaziv doğası ve büyük enfeksiyon riski ve yara kapandığında yara izi bırakması nedeniyle bu prosedürün birçok kez yapılmaması tavsiye edilir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek, yani yüksek frekansta uzun bir süre boyunca optimal görüntüleme koşullarını sağlamak ve aynı zamanda doku manipülasyonuna izin vermek için, MIW’nin değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) geliştirilmiş bir titanyum versiyonu, sağlıklı ve hastalıklı meme bezini birkaç gün ila2 . haftalar arasında görselleştirmek için tasarlanmıştır (Şekil 1A, B). R.MIW, IVM deneyinin tüm süresi boyunca doğrudan doku manipülasyonunu mümkün kılarak optimal doku erişimi sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır ve böylece meme bezinin uzun süre boyunca doğru zamanda ve yerde görselleştirilmesine izin verir. Kapatıldığında, R.MIW klasik MIW ile karşılaştırılabilir hava geçirmez bir sistem oluşturur (Şekil 1C). Aseptik koşullar altında açıldığında, R.MIW, optik erişimi iyileştirmek için lokal doku manipülasyonuna izin verir ve ayrıca yol inhibitörleri veya agonistleri, kanser hücresi veya bağışıklık hücresi popülasyonları gibi farklı hücre tiplerinin enjeksiyonu veya doku etiketleme boyalarının eklenmesi gibi maddelerin lokal olarak uygulanmasını sağlar. Kapak, görüntüleme seansları arasında altta yatan dokuya zarar vermeden her an açılabilir.
Resim 1: Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceresinin tasarımı. (A) Halkaya yapıştırılmış 10 mm’lik bir kapak camı ile meme görüntüleme penceresinin değiştirilebilir kapağının üstten görünümü ve yandan görünümü. (B) Bir çanta ipi dikişi kullanarak pencereyi farenin derisi içinde sabitlemek için aralarında bir oluk bulunan bir dış halka ve iç halkadan oluşan meme görüntüleme penceresinin üstten görünümü ve yandan görünümü. Dış bilezik, kapağın dört çıkıntısına (kollarına) uyan küçük bir oluğa sahiptir. (C) Kapağın açılma ve kapanma mekanizmalarını gösteren karikatür ve resimler. Eğimli çıkıntılar, kapağın pencere çerçevesinin içine sabitlendiğinden emin olur. Bu şekil Messal et al. 2. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, R.MIW’nin tasarım ve implantasyon prosedürünün yanı sıra aynı meme kanallarını tekrar ziyaret etmek ve hücresel çözünürlükte görselleştirmek için uzunlamasına bir IVM stratejisini açıklamaktadır. R.MIW, çeşitli floresan muhabir fare modellerinde meme bezinin farklı gelişimsel aşamalarında hücre bölünmelerini ve morfolojik değişiklikleri takip etmeyi sağlar. Birlikte ele alındığında, R.MIW, meme bezi gelişimi, homeostaz ve hastalık sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu kolaylaştırır.
R.MIW, doğal ve minimal olarak bozulmuş ortamında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin uzunlamasına görüntülenmesine izin verir ve meme bezinin çeşitli gelişim aşamalarında tekrar tekrar görselleştirilmesine izin verir. R.MIW tasarımı, pencerenin deney sırasında herhangi bir noktada açılmasını sağlar. İlgilenilen dokuya uzun süreli görsel erişim, örneğin, kapak kayması üzerinde hücre kalıntılarının birikmesiyle engellenebilir. Bu gibi durumlarda, R.MIW, tüm görünür doku alanının ve kapağın temizlenmesini sağlamak için bir görüntüleme seansından önce veya hemen sonra açılabilir. Çıkarılabilir kapak ayrıca dokunun manipülasyonuna ve spesifik inhibitörler ve tedaviler, etiketleme boyaları veya ilgilenilen spesifik hücre tipleri gibi maddelerin lokal uygulamasına izin verir.
Bu yöntem, bir görüntüleme seansı ile sınırlı olan daha önce tarif edilen meme deri flebi prosedürleri 4,7,8,13’ün sınırlamasının üstesinden gelir ve dallanma morfogenezi (Şekil 5), homeostatik doku döngüsü (Şekil 6) veya hücresel düzeyde tümör büyümesi (Şekil 3B) gibi süreçleri görselleştirebilir. ). Bununla birlikte, aynı zamanda, R.MIW, daha önce yayınlanan MIW3,18 ve diğer tüm görüntüleme pencereleri20,22’ye kıyasla R.MIW’nin büyük bir varlığını içeren görüntüleme oturumları arasında dokunun lokal manipülasyonuna izin verir. R.MIW’yi açarken, herhangi bir enfeksiyon kaynağını önlemek için her zaman aseptik koşulları korumak önemlidir. R.MIW’yi aseptik bir ortamda açma yeteneği, her görüntüleme seansından önce görüntüleme koşullarının optimize edilmesini sağlar ve bu da ilgilenilen dokuya uzun vadeli görsel erişimi büyük ölçüde geliştirir. Spesifik olarak, adiposit bakımından zengin bir stroma içine gömülü olan meme bezinde, bu çok değerlidir. Dahası, değiştirilebilir kapak, IVM deneyini sonlandırmaya gerek kalmadan terapötiklerin, farklı hücre tiplerinin, etiketleme boyalarının, görüntü rehberliğinde mikrodiseksiyonun veya dokunun başka herhangi bir lokal manipülasyonunun lokal olarak uygulanmasını benzersiz bir şekilde mümkün kılabilir. Örneğin, tümör başlangıcını incelemek için, spesifik kanser hücresi popülasyonları, bu ROI’ye R.MIW halkası aracılığıyla erişilebildiği sürece, belirlenmiş bir IVM zaman noktasında ve hassas meme bezi konumunda doğrudan duktal ağaca veya stromaya enjekte edilebilir. Tümör progresyonunu incelemek için, spesifik kanser hücresi popülasyonları (belirli bir yerde, belirli bir mikro ortamda veya belirli bir davranışla) IVM oturumu sırasında foto-işaretlenebilir ve daha sonra R.MIW’nin açılmasından sonra bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak mikrodiseke edilebilir. İzole hücreler, (tek hücreli) mRNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için daha fazla işlenebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, in vivo hücre davranışını moleküler ekspresyon profilleriyle birleştirebilirsiniz. R.MIW tarafından sağlanan lokal ilaç uygulamasının avantajı, dokunun tedaviden önce ve hemen sonra görüntülenmesini sağlar. Fareyi görüntüleme kutusundan çıkarmak ve daha sonra R.MIW kapağını açtıktan sonra lokal ilaç uygulamasını gerçekleştirmek için gereken aralık dakikalar içinde gerçekleştirilebilir ve bu da hızlı etkili ilaçların anında faz yakalamasını sağlar.
R.MIW aracılığıyla meme bezinin IVM’sinin birçok farklı floresan muhabir fare modeliyle uyumlu olduğunu gösteriyoruz. Yağ bakımından zengin ortamın görüntülenmesi zordur ve bu nedenle parlak floroforların kullanılması önerilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, mCFP gibi daha az parlak floroforlar bile optimum görüntüleme koşullarında R.MIW aracılığıyla görselleştirilebilir. Kaçınılmaz olarak, yağ yastığı daha derin duktal yapıların görüntülenmesini engelleyecek ve görüntülemeyi daha yüzeysel kanallarla sınırlayacaktır. Her IVM deneyinin başlangıcında düşük çözünürlüklü bir genel bakış görüntüsü, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeterince yüzeysel olan ilgili duktal yapıların belirlenmesine yardımcı olacaktır. Lokal doku manipülasyonu, bağ dokusunun çıkarılması veya R.MIW’yi açtıktan sonra yağ dokusunun yeniden konumlandırılması, IVM’yi yağ dokusu tarafından kaplanan spesifik ROI’ler için optimize edebilir. Bu, bu manipülasyonların yapılmasına izin vermeyen ve pencerenin kendisinin tamamen kaldırılmasını gerektiren önceki tüm pencere tasarımlarına göre önemli bir avantajdır. Spesifik olarak, inguinal lenf nodunun görselleştirilmesi için, ışık saçılımını azaltan ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi mümkün kılan üstteki yağ dokusunun nazikçe çıkarılması önerilir. Dokuyu manipüle ederken, her zaman aseptik koşulları koruyun ve IVM deneyi sırasında incelenen süreçleri etkileyebileceğinden, kanamayı veya dokuya ciddi hasarı önleyin.
R.MIW, eklemler veya kemik plakaları gibi sert dokuların yerini almak için klinik pratikte yaygın olarak kullanılan bir malzeme olan titanyumdan yapılmıştır. Titanyum, hafif ve inert karakteri21 de dahil olmak üzere çelik pencerelere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, esnek silikon pencere20 de dahil olmak üzere yeni görüntüleme penceresi tipleri oluşturmak için birkaç başka malzeme kullanıldı. R.MIW’nin aksine, esnek pencere implantasyon için herhangi bir dikiş gerektirmez ve özellikle yumuşak ve kırılgan dokular söz konusu olduğunda, hemen hemen her anatomik pozisyon için uygundur. Silikon pencereler, hafif ve deforme olabilen doğaları nedeniyle hayvan hareketliliği üzerinde minimum etkiye sahiptir ve belki de hızlı doku genişlemesi ve büyümesini inceleyen deneylerde daha uygundur20. Titanyum versiyona göre bir diğer avantaj, silikon pencerelerin manyetik rezonans görüntüleme20,27 dahil olmak üzere diğer görüntüleme modaliteleriyle uyumlu olmasıdır. Ancak, hedeflerin 0,17 mm cam kapaklar için optimize edildiğini akılda tutmak önemli olacaktır. Dahası, meme dokusu, özellikle ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldığında, esnek pencereyi kullanarak kısıtlanması zor olan solunum hareketlerine karşı hassastır. Solunum artefaktları, R.MIW tasarımı ve R.MIW’nin görüntüleme kutusunun kakma içine sabitlenmesi ile en aza indirilir. Sonuç olarak, önerilen R.MIW kurulumu kullanılarak elde edilen görüntüler, solunum eserleri nedeniyle bozulmaz. Bununla birlikte, doku lokalizasyonunda genellikle kademeli olan ve edinim sonrası hareket düzeltme yazılımı28 kullanılarak düzeltilebilen küçük sapmalar meydana gelebilir. IVM teknolojileri2,20’nin artan araç kutusuyla, her deney için özel gereksinimler sonunda ilgilenilen dokunun in vivo görselleştirmesinin en iyi yolunu belirleyecektir. Farklı pencere tasarımlarının farklı avantajları ve dezavantajları vardır ve araştırma sorusuna, mevcut mikroskopi kurulumuna, gerekli mekansal ve zamansal çözünürlüğe ve çalışılan sürecin toplam zaman aralığına bağlı olarak, en uygun yaklaşımın belirlenmesi gerekir.
Özetle, R.MIW, MEME BEZI GELIŞIMI, HOMEOSTAZ VE HASTALıK sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu birkaç gün ila haftalar boyunca kolaylaştırır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Araştırma Vakfı Flanders (doktora hibesi temel araştırma 11L7222N – M.C.), Boehringer Ingelheim Vakfı (C.L.G.J.S.’ye Doktora Bursu), bir EMBO doktora sonrası bursu (C.L.G.J.S.’ye ALTF 1035-2020 hibe) ve Doktor Josef Steiner Ödülü (J.v.R.’ye) tarafından desteklenmiştir.
0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
80% Ethanol | homemade | NA | |
Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
Eye ointment | Duratears | NA | |
Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
Imaging box | Custom made | NA | |
Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
Paper tape tesa | Tesa | NA | |
Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |