Denne artikkelen introduserer en enkel metode for rask produksjon av gigantiske unilamellar vesikler med innkapslede cytoskeletale proteiner. Metoden viser seg å være nyttig for nedenfra-og-opp-rekonstituering av cytoskeletale strukturer i innesperring og cytoskjelettmembraninteraksjoner.
Giant unilamellar vesicles (GUVs) brukes ofte som modeller av biologiske membraner og er dermed et flott verktøy for å studere membranrelaterte cellulære prosesser in vitro. De siste årene har innkapsling innen GUVs vist seg å være en nyttig tilnærming for rekonstitueringsforsøk i cellebiologi og relaterte felt. Det etterligner bedre innesperringsforhold inne i levende celler, i motsetning til konvensjonell biokjemisk rekonstituering. Metoder for innkapsling i GUVer er ofte ikke enkle å implementere, og suksessrater kan variere betydelig fra lab til lab. En teknikk som har vist seg å være vellykket for å innkapsle mer komplekse proteinsystemer kalles kontinuerlig dråpegrensesnitt kryssing innkapsling (cDICE). Her presenteres en cDICE-basert metode for raskt innkapsling av cytoskeletale proteiner i GUVer med høy innkapslingseffektivitet. I denne metoden genereres først lipidmonolayerdråper ved å emulgere en proteinløsning av interesse for en lipid / oljeblanding. Etter å ha blitt lagt inn i et roterende 3D-trykt kammer, passerer disse lipid-monolagede dråpene deretter gjennom et annet lipidmonolayer ved et vann / oljegrensesnitt inne i kammeret for å danne GUVer som inneholder proteinsystemet. Denne metoden forenkler den generelle prosedyren for innkapsling i GUVer og fremskynder prosessen, og lar oss dermed begrense og observere den dynamiske utviklingen av nettverksmontering inne i lipidbilayer vesikler. Denne plattformen er nyttig for å studere mekanikken til cytoskjelettmembraninteraksjoner i innesperring.
Lipid bilayer-rom brukes som modellsyntetiske celler for å studere lukkede organiske reaksjoner og membranbaserte prosesser eller som bæremoduler i legemiddelleveringsapplikasjoner 1,2. Bunn-opp biologi med rensede komponenter krever minimale eksperimentelle systemer for å utforske egenskaper og interaksjoner mellom biomolekyler, som proteiner og lipider 3,4. Men med utviklingen av feltet er det et økt behov for mer komplekse eksperimentelle systemer som bedre etterligner forholdene i biologiske celler. Innkapsling i GUVs er en praktisk tilnærming som kan tilby noen av disse cellelignende egenskapene ved å gi en deformerbar og selektivt gjennomtrengelig lipidbilayer og et begrenset reaksjonsrom. Spesielt kan in vitro rekonstituering av cytoskeletalsystemer, som modeller av syntetiske celler, dra nytte av innkapsling i membranrom5. Mange cytoskeletale proteiner binder og samhandler med cellemembranen. Ettersom de fleste cytoskeletale samlinger danner strukturer som spenner over hele cellen, bestemmes formen naturlig av cellestørrelsessperre6.
Ulike metoder brukes til å generere GUVs, for eksempel hevelse 7,8, liten vesicle fusion 9,10, emulsjon overføring11,12, pulsert jetting13, og andre mikrofluidiske tilnærminger14,15. Selv om disse metodene fortsatt brukes, har hver sine begrensninger. Dermed er en robust og grei tilnærming med høyt utbytte av GUV-innkapsling svært ønskelig. Selv om teknikker som spontan hevelse og elektroswelling er allment vedtatt for dannelsen av GUVer, er disse metodene først og fremst kompatible med spesifikke lipidsammensetninger16, lave saltkonsentrasjonsbuffere17, mindre innkapslet molekylær størrelse18, og krever et høyt volum av innkapslingen. Fusing flere små vesicles inn i en GUV er iboende energisk ugunstig, og krever dermed spesifisitet i ladede lipidsammensetninger9 og / eller eksterne fusjonsinduserende midler, for eksempel peptider19 eller andre kjemikalier. Emulsjonsoverføring og mikrofluidiske metoder kan derimot kreve dråpestabilisering gjennom overflateaktiv og fjerning av løsningsmiddel etter bilayerdannelse, henholdsvis18,20. Kompleksiteten i eksperimentelt oppsett og enhet i mikrofluidiske teknikker som pulserende jetting pålegger en ekstra utfordring21. cDICE er en emulsjonsbasert metode avledet fra lignende prinsipper som regulerer emulsjonsoverføring22,23. En vandig løsning (ytre løsning) og en lipidoljeblanding stratifiseres av sentrifugalkrefter i et roterende sylindrisk kammer (cDICE-kammer) som danner et lipidmettet grensesnitt. Shuttling lipid monolayered vandige dråper inn i roterende cDICE kammeret resulterer i zipping av en bilayer som dråper krysse lipid-mettet grensesnitt inn i den ytre vandig løsning22,24. CDICE-tilnærmingen er en robust teknikk for GUV-innkapsling. Med den presenterte modifiserte metoden oppnås ikke bare det høye vesicleutbyttet som er typisk for cDICE med en betydelig kortere innkapslingstid (noen få sekunder), men GUV-generasjonstid som tillater observasjon av tidsavhengige prosesser (f.eks. aktin cytoskeletal nettverksdannelse) reduseres betydelig. Protokollen tar omtrent 15-20 minutter fra starten til GUV-innsamling og avbildning. Her er GUV-generasjonen beskrevet ved hjelp av den modifiserte cDICE-metoden for å innkapsle aktin- og aktinbindende proteiner (ABPer). Den presenterte teknikken gjelder imidlertid for å innkapsle et bredt spekter av biologiske reaksjoner og membraninteraksjoner, fra montering av biopolymerer til cellefritt proteinuttrykk til membranfusjonsbasert lastoverføring.
Ulike metoder for å generere GUVs har blitt utforsket for etablering av syntetiske celler Men kompleksiteten i prosedyrene, utvidet tid til å oppnå innkapsling, begrensning av lipidtyper og molekylær sammensetning av innkapslingen, behovet for ikke-fysiologiske kjemikalier for å lette innkapsling, lavt GUV-utbytte og inkonsekvenser i innkapslingseffektivitet har fortsatt å utfordre forskere på dette feltet. Tatt i betraktning det brede spekteret av potensielle studier som kan tas i gang i bunn-opp syntetisk biolog…
The authors have nothing to disclose.
APL anerkjenner støtte fra humboldtstipend for erfarne forskere og fra National Science Foundation (1939310 og 1817909) og National Institutes of Health (R01 EB030031).
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Fascin | homemade | N/A | |
F-buffer | homemade | N/A | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
G-buffer | homemade | N/A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |