Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.
Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden vaak gebruikt als modellen van biologische membranen en zijn dus een geweldig hulpmiddel om membraangerelateerde cellulaire processen in vitro te bestuderen. In de afgelopen jaren is inkapseling binnen GUV’s een nuttige benadering gebleken voor reconstitutie-experimenten in celbiologie en aanverwante gebieden. Het bootst beter de opsluitingsomstandigheden in levende cellen na, in tegenstelling tot conventionele biochemische reconstitutie. Methoden voor inkapseling in GUVs zijn vaak niet eenvoudig te implementeren en slagingspercentages kunnen aanzienlijk verschillen van laboratorium tot laboratorium. Een techniek die succesvol is gebleken voor het inkapselen van complexere eiwitsystemen wordt continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) genoemd. Hier wordt een op cDICE gebaseerde methode gepresenteerd voor het snel inkapselen van cytoskeletale eiwitten in GUVs met een hoge inkapselingsefficiëntie. In deze methode worden eerst lipide-monolaagdruppels gegenereerd door een eiwitoplossing te emulgeren die van belang is in een lipide / oliemengsel. Nadat ze zijn toegevoegd aan een roterende 3D-geprinte kamer, gaan deze lipide-monolagige druppels vervolgens door een tweede lipide monolaag op een water / olie-interface in de kamer om GUVs te vormen die het eiwitsysteem bevatten. Deze methode vereenvoudigt de algemene procedure van inkapseling binnen GUV’s en versnelt het proces, en stelt ons dus in staat om de dynamische evolutie van netwerkassemblage in lipide bilayer blaasjes te beperken en te observeren. Dit platform is handig voor het bestuderen van de mechanica van cytoskelet-membraaninteracties in opsluiting.
Lipide dubbellaagse compartimenten worden gebruikt als model synthetische cellen voor het bestuderen van ingesloten organische reacties en op membraan gebaseerde processen of als dragermodules in toepassingen voor medicijnafgifte 1,2. Bottom-up biologie met gezuiverde componenten vereist minimale experimentele systemen om eigenschappen en interacties tussen biomoleculen, zoals eiwitten en lipiden, te onderzoeken 3,4. Met de vooruitgang van het veld is er echter een toegenomen behoefte aan complexere experimentele systemen die de omstandigheden in biologische cellen beter imiteren. Inkapseling in GUVs is een praktische benadering die een aantal van deze celachtige eigenschappen kan bieden door een vervormbare en selectief doorlatende lipide bilayer en een beperkte reactieruimte te bieden. Met name in vitro reconstitutie van cytoskeletsystemen, als modellen van synthetische cellen, kan baat hebben bij inkapseling in membraancompartimenten5. Veel cytoskeletale eiwitten binden en interageren met het celmembraan. Aangezien de meeste cytoskeletale assemblages structuren vormen die het geheel van de cel overspannen, wordt hun vorm natuurlijk bepaald door celgrote opsluiting6.
Verschillende methoden worden gebruikt om GUVs te genereren, zoals de zwelling 7,8, kleine blaasjesfusie 9,10, emulsieoverdracht11,12, gepulseerde jetting13 en andere microfluïdische benaderingen14,15. Hoewel deze methoden nog steeds worden gebruikt, heeft elk zijn beperkingen. Daarom is een robuuste en eenvoudige aanpak met een hoog rendement van GUV-inkapseling zeer wenselijk. Hoewel technieken zoals spontane zwelling en elektroswelling op grote schaal worden toegepast voor de vorming van GUVs, zijn deze methoden voornamelijk compatibel met specifieke lipidesamenstellingen16, buffers met lage zoutconcentraties17, kleinere encapsulant moleculaire grootte18 en vereisen ze een groot volume van het inkapselingsmiddel. Het fuseren van meerdere kleine blaasjes tot een GUV is inherent energetisch ongunstig, waardoor specificiteit vereist is in geladen lipidesamenstellingen9 en / of externe fusie-inducerende middelen, zoals peptiden19 of andere chemicaliën. Emulsieoverdracht en microfluïdische methoden kunnen daarentegen druppelstabilisatie vereisen door verwijdering van oppervlakteactieve stoffen en oplosmiddelen na dubbellaagse vorming, respectievelijk18,20. De complexiteit van experimentele opstelling en apparaat in microfluïdische technieken zoals gepulseerde jetting vormen een extra uitdaging21. cDICE is een op emulsie gebaseerde methode die is afgeleid van vergelijkbare principes voor emulsieoverdracht22,23. Een waterige oplossing (buitenoplossing) en een lipide-oliemengsel worden gestratificeerd door centrifugale krachten in een roterende cilindrische kamer (cDICE-kamer) die een lipide verzadigd interface vormen. Het dichtknijpen van lipide monolaged waterige druppels in de roterende cDICE-kamer resulteert in het ritsen van een dubbellaag terwijl druppels de lipide-verzadigde interface doorkruisen naar de buitenste waterige oplossing22,24. De cDICE-aanpak is een robuuste techniek voor GUV-inkapseling. Met de gepresenteerde gemodificeerde methode wordt niet alleen de hoge blaasjesopbrengst bereikt die typisch is voor cDICE met een aanzienlijk kortere inkapselingstijd (enkele seconden), maar wordt ook de GUV-generatietijd bereikt die de observatie van tijdsafhankelijke processen mogelijk maakt (bijv. Actine cytoskeletale netwerkvorming) aanzienlijk verminderd. Het protocol duurt ongeveer 15-20 minuten vanaf het begin tot GUV-verzameling en beeldvorming. Hier wordt GUV-generatie beschreven met behulp van de gemodificeerde cDICE-methode voor het inkapselen van actine en actine-bindende eiwitten (ABPs). De gepresenteerde techniek is echter toepasbaar voor het inkapselen van een breed scala aan biologische reacties en membraaninteracties, van de assemblage van biopolymeren tot celvrije eiwitexpressie tot op membraanfusie gebaseerde ladingoverdracht.
Verschillende methoden voor het genereren van GUVs zijn onderzocht voor de creatie van synthetische cellen De complexiteit van de procedures, de langere tijd om inkapseling te bereiken, beperking van lipidetypen en moleculaire samenstelling van het inkapselingsmiddel, behoefte aan niet-fysiologische chemicaliën om inkapseling te vergemakkelijken, lage GUV-opbrengst en inconsistenties in inkapselingsefficiëntie blijven onderzoekers op dit gebied uitdagen. Gezien het brede scala aan potentiële studies die kunnen worden …
The authors have nothing to disclose.
APL erkent steun van een Humboldt Research Fellowship for Experienced Researchers en van de National Science Foundation (1939310 and 1817909) en National Institutes of Health (R01 EB030031).
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Fascin | homemade | N/A | |
F-buffer | homemade | N/A | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
G-buffer | homemade | N/A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |