Incapsulamento rapido del citoscheletro ricostituito all'interno di vescicole unilamellari giganti

Yashar Bashirzadeh; Nadab Wubshet; Thomas Litschel; Petra Schwille; Allen P. Liu

doi:10.3791/63332

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Articolo metodologico

Incapsulamento rapido del citoscheletro ricostituito all'interno di vescicole unilamellari giganti

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DOI:

10.3791/63332

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10 novembre 2021

Yashar Bashirzadeh^*¹ , Nadab Wubshet^*¹ , Thomas Litschel² , Petra Schwille³ , Allen P. Liu¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ²John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, ³Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, ⁴Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo introduce un metodo semplice per la produzione rapida di vescicole unilamellari giganti con proteine citoscheletriche incapsulate. Il metodo si rivela utile per la ricostituzione bottom-up delle strutture citoscheletriche nelle interazioni confinamento e citoscheletro-membrana.

Abstract

Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono spesso utilizzate come modelli di membrane biologiche e quindi sono un ottimo strumento per studiare i processi cellulari correlati alla membrana in vitro. Negli ultimi anni, l'incapsulamento all'interno dei GUV ha dimostrato di essere un approccio utile per esperimenti di ricostituzione in biologia cellulare e campi correlati. Imita meglio le condizioni di confinamento all'interno delle cellule viventi, al contrario della ricostituzione biochimica convenzionale. I metodi per l'incapsulamento all'interno dei GUV spesso non sono facili da implementare e le percentuali di successo possono differire significativamente da laboratorio a laboratorio. Una tecnica che ha dimostrato di avere successo nell'incapsulare sistemi proteici più complessi è chiamata incapsulamento continuo dell'interfaccia goccioline che attraversa l'incapsulamento (cDICE). Qui, viene presentato un metodo basato su cDICE per incapsulare rapidamente proteine citoscheletriche in GUV con elevata efficienza di incapsulamento. In questo metodo, in primo luogo, le goccioline lipidiche-monostrato vengono generate emulsionando una soluzione proteica di interesse in una miscela lipidico/oleosa. Dopo essere state aggiunte in una camera rotante stampata in 3D, queste goccioline lipidiche-monostrato passano quindi attraverso un secondo monostrato lipidico in un'interfaccia acqua / olio all'interno della camera per formare GUV che contengono il sistema proteico. Questo metodo semplifica la procedura generale di incapsulamento all'interno dei GUV e accelera il processo, e quindi ci consente di confinare e osservare l'evoluzione dinamica dell'assemblaggio della rete all'interno di vescicole lipidiche a doppio strato. Questa piattaforma è utile per studiare la meccanica delle interazioni citoscheletro-membrana nel confinamento.

Introduzione

I compartimenti lipidici a doppio strato sono utilizzati come cellule sintetiche modello per lo studio di reazioni organiche chiuse e processi basati su membrana o come moduli portanti in applicazioni di somministrazione di farmaci ^1,2. La biologia bottom-up con componenti purificati richiede sistemi sperimentali minimi per esplorare le proprietà e le interazioni tra biomolecole, come proteine e lipidi ^3,4. Tuttavia, con l'avanzamento del campo, c'è una maggiore necessità di sistemi sperimentali più complessi che imitino meglio le condizioni nelle cell....