Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes
Summary
Este artigo introduz um método simples para a produção rápida de vesículas unilamellar gigantes com proteínas citoesqueletal encapsuladas. O método se mostra útil para a reconstituição de estruturas citoesqueletal em interações de confinamento e citoesqueleto-membrana.
Abstract
Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são frequentemente usadas como modelos de membranas biológicas e, portanto, são uma ótima ferramenta para estudar processos celulares relacionados à membrana in vitro. Nos últimos anos, o encapsulamento dentro dos GUVs provou ser uma abordagem útil para experimentos de reconstituição em biologia celular e campos relacionados. Ele imita melhor as condições de confinamento dentro das células vivas, em oposição à reconstituição bioquímica convencional. Métodos de encapsulamento dentro de GUVs muitas vezes não são fáceis de implementar, e as taxas de sucesso podem diferir significativamente de laboratório para laboratório. Uma técnica que tem sido bem sucedida para encapsular sistemas proteicos mais complexos é chamada de encapsulamento contínuo de cruzamento de interface de gotícula (cDICE). Aqui, um método baseado em cDICE é apresentado para encapsular rapidamente proteínas citoesqueletal em GUVs com alta eficiência de encapsulamento. Neste método, primeiro, gotículas lipídicas-monocamadas são geradas pela emulsificação de uma solução proteica de interesse em uma mistura lipídica/óleo. Depois de serem adicionados em uma câmara impressa em 3D rotativa, essas gotículas lipídicas-monocamadas passam por uma segunda monocamada lipídica em uma interface água/óleo dentro da câmara para formar GUVs que contêm o sistema de proteínas. Este método simplifica o procedimento global de encapsulamento dentro dos GUVs e acelera o processo, e assim nos permite limitar e observar a evolução dinâmica do conjunto de rede dentro de vesículas lipídicas bicamadas. Esta plataforma é útil para estudar a mecânica das interações citoesqueleto-membrana no confinamento.
Introduction
Os compartimentos de bicamadas lipídicas são usados como modelo de células sintéticas para estudar reações orgânicas fechadas e processos baseados em membrana ou como módulos portadores em aplicações de entrega de medicamentos 1,2. A biologia de baixo para cima com componentes purificados requer sistemas experimentais mínimos para explorar propriedades e interações entre biomoléculas, como proteínas e lipídios 3,4. No entanto, com o avanço do campo, há uma necessidade aumentada de sistemas experimentais mais complexos que imitem melhor as condições nas células biológicas. Encapsulamento em GUVs é uma abordagem prática que pode oferecer algumas dessas propriedades semelhantes a células, fornecendo uma bicamada lipídica deformável e seletivamente permeável e um espaço de reação confinado. Em particular, a reconstituição in vitro de sistemas citoesqueléticos, como modelos de células sintéticas, pode beneficiar da encapsulamento nos compartimentosde membrana 5. Muitas proteínas citoesqueléticas se ligam e interagem com a membrana celular. Como a maioria dos conjuntos citoesqueléticos formam estruturas que abrangem toda a célula, sua forma é naturalmente determinada pelo confinamento do tamanho decélulas 6.
Diferentes métodos são utilizados para gerar GUVs, como o inchaço 7,8, pequena fusão vesícula 9,10, transferência de emulsão11,12, hastil13 pulsado e outras abordagens microfluidas14,15. Embora esses métodos ainda sejam utilizados, cada um tem suas limitações. Assim, uma abordagem robusta e direta com alto rendimento de encapsulamento guv é altamente desejável. Embora técnicas como inchaço espontâneo e eletroswelling sejam amplamente adotadas para a formação de GUVs, esses métodos são principalmente compatíveis com composições lipídicas específicas16, tampões de baixa concentração de sal17, menor tamanho molecular encapsulante18, e requerem um alto volume do encapsulante. A fusão de múltiplas pequenas vesículas em um GUV é inerentemente energeticamente desfavorável, exigindo assim especificidade em composições lipídicas carregadas9 e/ou agentes indutores de fusão externos, como peptídeos19 ou outros produtos químicos. A transferência de emulsão e os métodos microfluidos, por outro lado, podem exigir estabilização de gotículas através da remoção de surfactante e solvente após a formação de bicamadas, respectivamente18,20. A complexidade da configuração experimental e do dispositivo em técnicas microfluidas, como o haseamento pulsado, impõem um desafio adicional21. cDICE é um método baseado em emulsão derivado de princípios semelhantes que regem a transferência de emulsão22,23. Uma solução aquosa (solução externa) e uma mistura lipídica-óleo são estratificadas por forças centrífugas em uma câmara cilíndrica rotativa (câmara cDICE) formando uma interface saturada lipídica. Fechar gotículas aquosas lipídicas na câmara cDICE rotativa resulta em zipping de um bicamado enquanto gotículas cruzam a interface lipídica-saturada na solução aquosa externa22,24. A abordagem cDICE é uma técnica robusta para encapsulamento guv. Com o método modificado apresentado, não apenas o alto rendimento de vesícula típico para cDICE com um tempo de encapsulamento significativamente menor (alguns segundos) é alcançado, mas o tempo de geração de GUV que permite a observação de processos dependentes do tempo (por exemplo, formação de rede citosqueletal actin) é significativamente reduzido. O protocolo leva cerca de 15-20 minutos desde o início até a coleta e imagem do GUV. Aqui, a geração de GUV é descrita usando o método cDICE modificado para encapsular actina e proteínas de ligação de actina (ABPs). No entanto, a técnica apresentada é aplicável para encapsular uma ampla gama de reações biológicas e interações de membrana, desde a montagem de biopolímeros até a expressão proteica livre de células até a transferência de carga baseada em fusão de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes métodos de geração de GUVs têm sido explorados para a criação de células sintéticas No entanto, a complexidade dos procedimentos, o tempo estendido para alcançar o encapsulamento, a restrição dos tipos lipídicos e a composição molecular do encapsulador, a necessidade de produtos químicos não fisiológicos para facilitar o encapsulamento, o baixo rendimento do GUV e as inconsistências na eficiência do encapsulamento continuaram a desafiar os pesquisadores neste campo. Considerando a ampla gama…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A APL reconhece o apoio de uma Bolsa de Pesquisa Humboldt para Pesquisadores Experientes e da Fundação Nacional de Ciência (1939310 e 1817909) e institutos nacionais de saúde (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
Riferimenti
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