Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes
Summary
Este artículo presenta un método simple para la producción expedita de vesículas unilamelares gigantes con proteínas citoesqueléticas encapsuladas. El método demuestra ser útil para la reconstitución ascendente de estructuras citoesqueléticas en confinamiento e interacciones citoesqueleto-membrana.
Abstract
Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) se utilizan con frecuencia como modelos de membranas biológicas y, por lo tanto, son una gran herramienta para estudiar los procesos celulares relacionados con la membrana in vitro. En los últimos años, la encapsulación dentro de los GUV ha demostrado ser un enfoque útil para los experimentos de reconstitución en biología celular y campos relacionados. Imita mejor las condiciones de confinamiento dentro de las células vivas, a diferencia de la reconstitución bioquímica convencional. Los métodos para la encapsulación dentro de los GUV a menudo no son fáciles de implementar, y las tasas de éxito pueden diferir significativamente de un laboratorio a otro. Una técnica que ha demostrado ser exitosa para encapsular sistemas de proteínas más complejos se llama encapsulación de cruce de interfaz de gota continua (cDICE). Aquí, se presenta un método basado en cDICE para encapsular rápidamente proteínas citoesqueléticas en GUV con alta eficiencia de encapsulación. En este método, en primer lugar, se generan gotas de lípido-monocapa al emulsionar una solución proteica de interés en una mezcla de lípidos / aceites. Después de ser agregadas a una cámara rotativa impresa en 3D, estas gotas de monocapa lipídica pasan a través de una segunda monocapa lipídica en una interfaz agua/aceite dentro de la cámara para formar GUV que contienen el sistema de proteínas. Este método simplifica el procedimiento general de encapsulación dentro de los GUV y acelera el proceso, y por lo tanto nos permite confinar y observar la evolución dinámica del ensamblaje de la red dentro de las vesículas bicapa lipídicas. Esta plataforma es útil para estudiar la mecánica de las interacciones citoesqueleto-membrana en confinamiento.
Introduction
Los compartimentos bicapa lipídicos se utilizan como células sintéticas modelo para estudiar reacciones orgánicas cerradas y procesos basados en membranas o como módulos portadores en aplicaciones de administración de fármacos 1,2. La biología de abajo hacia arriba con componentes purificados requiere sistemas experimentales mínimos para explorar propiedades e interacciones entre biomoléculas, como proteínas y lípidos 3,4. Sin embargo, con el avance del campo, existe una mayor necesidad de sistemas experimentales más complejos que imiten mejor las condiciones en las células biológicas. La encapsulación en GUV es un enfoque práctico que puede ofrecer algunas de estas propiedades similares a las células al proporcionar una bicapa lipídica deformable y selectivamente permeable y un espacio de reacción confinado. En particular, la reconstitución in vitro de sistemas citoesqueléticos, como modelos de células sintéticas, puede beneficiarse de la encapsulación en compartimentos de membrana5. Muchas proteínas citoesqueléticas se unen e interactúan con la membrana celular. Como la mayoría de los ensamblajes citoesqueléticos forman estructuras que abarcan la totalidad de la célula, su forma está determinada naturalmente por el confinamiento del tamaño de una célula6.
Se utilizan diferentes métodos para generar GUV, como la hinchazón 7,8, la fusión de vesículas pequeñas 9,10, la transferencia de emulsión 11,12, el chorro pulsado13 y otros enfoques microfluídicos 14,15. Aunque estos métodos todavía se utilizan, cada uno tiene sus limitaciones. Por lo tanto, un enfoque robusto y directo con un alto rendimiento de encapsulación GUV es altamente deseable. Aunque técnicas como la hinchazón espontánea y el electroswelling son ampliamente adoptadas para la formación de GUV, estos métodos son principalmente compatibles con composiciones lipídicas específicas16, tampones de baja concentración de sal17, tamaño molecular encapsulante más pequeño18 y requieren un alto volumen del encapsulante. La fusión de múltiples vesículas pequeñas en un GUV es inherentemente energéticamente desfavorable, por lo que requiere especificidad en las composiciones lipídicas cargadas9 y / o agentes externos inductores de fusión, como péptidos19 u otros productos químicos. La transferencia de emulsión y los métodos microfluídicos, por otro lado, pueden requerir la estabilización de gotas a través de la eliminación de surfactantes y solventes después de la formación de bicapas, respectivamente18,20. La complejidad de la configuración experimental y el dispositivo en técnicas microfluídicas como el chorro pulsado imponen un desafío adicional21. cDICE es un método basado en emulsiones derivado de principios similares que rigen la transferencia de emulsión22,23. Una solución acuosa (solución externa) y una mezcla de lípidos y aceite se estratifican por fuerzas centrífugas en una cámara cilíndrica giratoria (cámara cDICE) formando una interfaz saturada de lípidos. El traslado de gotas acuosas monocapas lipídicas a la cámara cDICE giratoria da como resultado la compresión de una bicapa a medida que las gotas atraviesan la interfaz saturada de lípidos hacia la solución acuosa externa22,24. El enfoque cDICE es una técnica robusta para la encapsulación GUV. Con el método modificado presentado, no solo se logra el alto rendimiento de vesículas típico de cDICE con un tiempo de encapsulación significativamente más corto (unos pocos segundos), sino que el tiempo de generación de GUV que permite la observación de procesos dependientes del tiempo (por ejemplo, la formación de redes citoesqueléticas de actina) se reduce significativamente. El protocolo tarda unos 15-20 minutos desde el inicio de la recolección de GUV y las imágenes. Aquí, la generación de GUV se describe utilizando el método cDICE modificado para encapsular actina y proteínas de unión a actina (ABP). Sin embargo, la técnica presentada es aplicable para encapsular una amplia gama de reacciones biológicas e interacciones de membrana, desde el ensamblaje de biopolímeros hasta la expresión de proteínas libres de células y la transferencia de carga basada en la fusión de membranas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han explorado diferentes métodos de generación de GUV para la creación de células sintéticas Sin embargo, la complejidad de los procedimientos, el tiempo prolongado para lograr la encapsulación, la restricción de los tipos de lípidos y la composición molecular del encapsulante, la necesidad de productos químicos no fisiológicos para facilitar la encapsulación, el bajo rendimiento de GUV y las inconsistencias en la eficiencia de la encapsulación han seguido desafiando a los investigadores en este campo. Te…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APL reconoce el apoyo de una beca de investigación Humboldt para investigadores experimentados y de la Fundación Nacional de Ciencias (1939310 y 1817909) y los Institutos Nacionales de Salud (R01 EB030031).
Materials
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
Riferimenti
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
- Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
- Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochimica. 36 (7), 1628-1634 (1997).
- Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochimica. 37 (8), 2361-2371 (1998).
- Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
- Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
- Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).
