Denna artikel introducerar en enkel metod för snabb produktion av gigantiska unilamellarblåsor med inkapslade cytoskelettproteiner. Metoden visar sig vara användbar för bottom-up rekonstitution av cytoskelettstrukturer i inneslutning och cytoskelett-membraninteraktioner.
Gigantiska unilamellarblåsor (GUV) används ofta som modeller av biologiska membran och är därför ett utmärkt verktyg för att studera membranrelaterade cellulära processer in vitro. Under de senaste åren har inkapsling inom GUVs visat sig vara ett användbart tillvägagångssätt för rekonstitueringsexperiment inom cellbiologi och relaterade områden. Det efterliknar bättre inneslutningsförhållanden inuti levande celler, i motsats till konventionell biokemisk rekonstituering. Metoder för inkapsling inuti GUVs är ofta inte lätta att implementera, och framgångsgraden kan skilja sig avsevärt från labb till labb. En teknik som har visat sig vara framgångsrik för att kapsla in mer komplexa proteinsystem kallas continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Här presenteras en cDICE-baserad metod för att snabbt kapsla in cytoskelettproteiner i GUV med hög inkapslingseffektivitet. I denna metod genereras först lipid-monolagerdroppar genom att emulgera en proteinlösning av intresse i en lipid / oljeblandning. Efter att ha tillsatts i en roterande 3D-tryckt kammare passerar dessa lipid-monolagerade droppar sedan genom ett andra lipidmonolager vid ett vatten / oljegränssnitt inuti kammaren för att bilda GUVs som innehåller proteinsystemet. Denna metod förenklar det övergripande förfarandet för inkapsling inom GUV och påskyndar processen, och gör det därmed möjligt för oss att begränsa och observera den dynamiska utvecklingen av nätverksmontering inuti lipid-dubbelskiktsblåsor. Denna plattform är praktisk för att studera mekaniken för cytoskelett-membraninteraktioner i inneslutning.
Lipid-dubbelskiktsfack används som modellsyntetiska celler för att studera slutna organiska reaktioner och membranbaserade processer eller som bärarmoduler i läkemedelsleveransapplikationer 1,2. Bottom-up biologi med renade komponenter kräver minimala experimentella system för att utforska egenskaper och interaktioner mellan biomolekyler, såsom proteiner och lipider 3,4. Men med fältets framsteg finns det ett ökat behov av mer komplexa experimentella system som bättre imiterar förhållandena i biologiska celler. Inkapsling i GUVs är ett praktiskt tillvägagångssätt som kan erbjuda några av dessa cellliknande egenskaper genom att tillhandahålla ett deformerbart och selektivt permeabelt lipid-dubbelskikt och ett begränsat reaktionsutrymme. I synnerhet kan in vitro-rekonstituering av cytoskelettsystem, som modeller av syntetiska celler, dra nytta av inkapsling i membranfack5. Många cytoskelettproteiner binder och interagerar med cellmembranet. Eftersom de flesta cytoskelettaggregat bildar strukturer som sträcker sig över hela cellen, bestäms deras form naturligt av cellstorlek6.
Olika metoder används för att generera GUV, såsom svullnad 7,8, liten vesikelfusion 9,10, emulsionsöverföring11,12, pulserad sprutning13 och andra mikrofluidiska tillvägagångssätt14,15. Även om dessa metoder fortfarande används, har var och en sina begränsningar. Således är ett robust och enkelt tillvägagångssätt med ett högt utbyte av GUV-inkapsling mycket önskvärt. Även om tekniker som spontan svullnad och elektroswelling används allmänt för bildandet av GUV, är dessa metoder främst kompatibla med specifika lipidkompositioner16, låg saltkoncentrationsbuffertar17, mindre inkapslingsmolekylstorlek18 och kräver en hög volym av inkapslingsmedlet. Att smälta samman flera små vesiklar till en GUV är i sig energiskt ogynnsamt, vilket kräver specificitet i laddade lipidkompositioner9 och / eller externa fusionsinducerande medel, såsom peptider19 eller andra kemikalier. Emulsionsöverföring och mikrofluidiska metoder kan å andra sidan kräva droppstabilisering genom avlägsnande av ytaktivt medel och lösningsmedel efter tvåskiktsbildning, respektive18,20. Komplexiteten i experimentell installation och anordning i mikrofluidiska tekniker som pulserad jetting innebär en ytterligare utmaning21. cDICE är en emulsionsbaserad metod härledd från liknande principer för emulsionsöverföring22,23. En vattenlösning (yttre lösning) och en lipid-oljeblandning stratifieras av centrifugalkrafter i en roterande cylindrisk kammare (cDICE-kammare) som bildar ett lipidmättat gränssnitt. Shuttling lipid monolayered vattenhaltiga droppar i den roterande cDICE-kammaren resulterar i zipping av ett dubbelskikt när droppar korsar det lipidmättade gränssnittet i den yttre vattenhaltiga lösningen22,24. cDICE-metoden är en robust teknik för GUV-inkapsling. Med den presenterade modifierade metoden uppnås inte bara det höga vesikelutbytet som är typiskt för cDICE med en signifikant kortare inkapslingstid (några sekunder) utan GUV-genereringstid som möjliggör observation av tidsberoende processer (t.ex. aktin cytoskelettnätverksbildning) reduceras avsevärt. Protokollet tar ca 15-20 min från start till GUV insamling och avbildning. Här beskrivs GUV-generering med hjälp av den modifierade cDICE-metoden för inkapsling av aktin och aktinbindande proteiner (ABPs). Den presenterade tekniken är emellertid tillämplig för att kapsla in ett brett spektrum av biologiska reaktioner och membraninteraktioner, från sammansättning av biopolymerer till cellfritt proteinuttryck till membranfusionsbaserad lastöverföring.
Olika metoder för att generera GUV har undersökts för skapandet av syntetiska celler Men komplexiteten i procedurerna, förlängd tid för att uppnå inkapsling, begränsning av lipidtyper och molekylär sammansättning av inkapslingsmedlet, behovet av icke-fysiologiska kemikalier för att underlätta inkapsling, lågt GUV-utbyte och inkonsekvenser i inkapslingseffektivitet har fortsatt att utmana forskare inom detta område. Med tanke på det breda utbudet av potentiella studier som kan inledas inom syntetisk biologi…
The authors have nothing to disclose.
APL erkänner stöd från ett Humboldt Research Fellowship for Experienced Researchers och från National Science Foundation (1939310 and 1817909) och National Institutes of Health (R01 EB030031).
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Fascin | homemade | N/A | |
F-buffer | homemade | N/A | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
G-buffer | homemade | N/A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |