Выделение митохондрий из скелетных мышц мыши для респирометрических анализов
Summary
Здесь мы описываем подробный метод выделения митохондрий из скелетных мышц мыши и последующий анализ дыхания по скорости потребления кислорода (OCR) с использованием респирометрических анализов на основе микропластин. Этот конвейер может быть применен для изучения влияния многочисленных экологических или генетических вмешательств на митохондриальный метаболизм.
Abstract
Большая часть энергии клетки получается за счет деградации глюкозы, жирных кислот и аминокислот различными путями, которые сходятся в системе митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS), которая регулируется в ответ на клеточные потребности. Липидная молекула коэнзима Q (CoQ) имеет важное значение в этом процессе путем переноса электронов в комплекс III в цепи переноса электронов (ETC) через постоянные циклы окисления / восстановления. Статус митохондрий и, в конечном счете, здоровье клеток можно оценить, измеряя потребление кислорода внеземными цивилизациями с использованием респирометрических анализов. Эти исследования обычно проводятся в установленных или первичных клеточных линиях, которые культивировались в течение нескольких дней. В обоих случаях полученные параметры дыхания могли отклоняться от нормальных физиологических условий в любом данном органе или ткани.
Кроме того, внутренние характеристики культивируемых одиночных волокон, выделенных из скелетных мышц, препятствуют этому типу анализа. В данной работе представлен обновленный и подробный протокол анализа дыхания в свежеизолированных митохондриях скелетных мышц мыши. Мы также предоставляем решения потенциальных проблем, которые могут возникнуть на любом этапе процесса. Метод, представленный здесь, может быть применен для сравнения показателей потребления кислорода в различных трансгенных моделях мышей и изучения митохондриального ответа на медикаментозное лечение или другие факторы, такие как старение или пол. Это возможный метод ответа на важнейшие вопросы о метаболизме и регуляции митохондриальной биоэнергетики.
Introduction
Митохондрии являются первичными метаболическими органеллами в клетке1. Эти специализированные мембранно-закрытые органеллы используют молекулы питательных веществ для производства энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) OXPHOS. Этот процесс основан на переносе электронов от донорских молекул в серии окислительно-восстановительных реакций в ETC2. CoQ является единственным окислительно-активным липидом, который эндогенно вырабатывается во всех клеточных мембранах и циркулирующих липопротеинах, которые проявляют антиоксидантную функцию3. Это важный компонент ETC, передающий электроны из NADH-зависимого комплекса I и FADH2-зависимого комплекса II в комплекс III, хотя многие другие редуктазы могут стимулировать восстановление митохондриального CoQ до убихинола в качестве обязательного шага в нескольких клеточных метаболических путях4,5.
На протяжении всего процесса через внутреннюю мембрану митохондрий создается электрохимический протонный градиент, который преобразуется в биологически активную энергию комплексом АТФ-синтазы V2. Следовательно, митохондриальная дисфункция приводит к множеству патологических состояний, в основном затрагивающих ткани с высокими энергетическими потребностями – мозг, сердце и скелетные мышцы6,7. Поэтому крайне важно разработать методы точного анализа митохондриальной биоэнергетики для изучения ее роли в здоровье и болезнях, особенно в высокоэнергетических тканях, таких как скелетные мышцы.
Кислородный электрод типа Кларка был классически использован при изучении митохондриального дыхания8. Однако эта система постепенно вытесняется технологиями с более высоким разрешением, причем особенно популярны технологии потребления кислорода на основе микропластин, такие как анализаторы Agilent Seahorse XF9. В области скелетных мышц эти исследования обычно проводятся в культивируемых клетках, главным образом в увековеченной клеточной линии миобластов C2C12 или первичных культурах, полученных из клеток-сателлитов10,11. Тем не менее, эти исследования не полностью повторяют ситуацию in vivo, особенно при изучении митохондриальной биологии и функционирования на тканевом уровне при конкретных нарушениях, негенетических вмешательствах или генетических манипуляциях.
Кроме того, анализ дыхания в клетках является более сложным из-за дополнительных факторов, включая внемитохондриальную потребность в АТФ и субстратах анализа или сигнальные события, которые могут ввести в заблуждение интерпретацию результатов. В качестве альтернативы также возможно использование одиночных или пучков свежеизолированных миофиберов из мышц. Тем не менее, метод изоляции технически сложен и осуществим только для нескольких типов мышц. В этом случае в основном используются мышцы сгибателя digitorum brevis (FDB) и разгибателя digitorum longus (EDL)10,12,13, хотя в нескольких отчетах также описывается использование других типов мышц14,15.
Также сообщалось о биоэнергетическом профилировании участков скелетных мышц16. Основным преимуществом этого метода является то, что интактные мышцы могут быть изучены (авторы показывают, что нарезка через волокна не нарушает результаты по сравнению с изолированными миофибрами). Однако митохондриальный доступ к субстратам и ингибиторам анализа ограничен, и, таким образом, можно измерить лишь несколько параметров16. Наконец, изолированные митохондрии также могут быть использованы9,17,18,19. В этом случае митохондрии теряют цитозольную среду, что может повлиять на их функцию. Напротив, этот метод гарантирует доступ к субстратам и ингибиторам, позволяет анализировать множество типов образцов и, как правило, требует меньше материала.
В данной работе описан метод выполнения биоэнергетического профилирования изолированных митохондрий из скелетных мышц мыши с использованием респирометрических анализов на основе микропластин (рисунок 1). В частности, подробно описаны три протокола: Анализ связи, CA для оценки степени связи между ETC и механизмом OXPHOS; Анализ потока электронов, EFA для измерения активности отдельных комплексов внеземных цивилизаций; и анализ BOX для определения митохондриальной β окислительной способности. Примечательно, что требуется только небольшое количество образцов по сравнению с обычными методами респирометрии. Используемый здесь протокол изоляции был изменен по сравнению с методом, опубликованным в другом месте18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все методы, используемые для изучения митохондриального дыхания, имеют свои ограничения; следовательно, крайне важно выбрать метод, который наилучшим образом соответствует конкретному экспериментальному вопросу. Эта работа предоставляет обновленный и подробный протокол для изоляци…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить Juan J. Tena за использование гомогенизатора и объектов CABD Proteomics and Animal Farming за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством образования, культуры и спорта Испании через стипендию FPU16/03264 для J.D.H.C., Ассоциацию Française contre les Myopathies (AFM) через стипендиальный грант No 22450 для C.V.-G., институциональный грант MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Департамент регуляции генов и морфогенеза в CABD) и BFU2017-83150-P для J.J.C. Грант Хунты Андалусии P18-RT-4572, Программа финансирования FEDER от Европейского Союза и Министерство науки, инноваций и университетов Испании предоставляют RED2018-102576-T P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
Riferimenti
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
