Isolering af mitokondrier fra museskeletmuskulatur til respirometriske assays
Summary
Her beskriver vi en detaljeret metode til mitokondrier isolering fra musens skeletmuskulatur og den efterfølgende analyse af åndedræt ved Oxygen Consumption Rate (OCR) ved hjælp af mikropladebaserede respirometriske assays. Denne rørledning kan anvendes til at studere virkningerne af flere miljømæssige eller genetiske indgreb på mitokondriemetabolisme.
Abstract
Det meste af cellens energi opnås ved nedbrydning af glucose, fedtsyrer og aminosyrer ved forskellige veje, der konvergerer på mitokondrieoxidativ phosphorylering (OXPHOS) -systemet, som reguleres som reaktion på cellulære krav. Lipidmolekylet Coenzym Q (CoQ) er afgørende i denne proces ved at overføre elektroner til kompleks III i elektrontransportkæden (ETC) gennem konstante oxidations- / reduktionscyklusser. Mitokondrier status og i sidste ende cellulær sundhed kan vurderes ved at måle ETC iltforbrug ved hjælp af respirometriske assays. Disse undersøgelser udføres typisk i etablerede eller primære cellelinjer, der er blevet dyrket i flere dage. I begge tilfælde kan de opnåede respirationsparametre have afveget fra normale fysiologiske forhold i et givet organ eller væv.
Derudover hindrer de iboende egenskaber ved dyrkede enkeltfibre isoleret fra skeletmuskulatur denne type analyse. Dette papir præsenterer en opdateret og detaljeret protokol til analyse af åndedræt i friskisolerede mitokondrier fra museskeletmuskulatur. Vi leverer også løsninger på potentielle problemer, der kan opstå på ethvert trin i processen. Den metode, der præsenteres her, kan anvendes til at sammenligne iltforbrugshastigheder i forskellige transgene musemodeller og studere mitokondrieresponset på lægemiddelbehandlinger eller andre faktorer såsom aldring eller køn. Dette er en gennemførlig metode til at svare på afgørende spørgsmål om mitokondriel bioenergetik metabolisme og regulering.
Introduction
Mitokondrier er de primære metaboliske organeller i cellen1. Disse specialiserede membranlukkede organeller bruger næringsmolekyler til at producere energi i form af adenosintrifosfat (ATP) af OXPHOS. Denne proces er afhængig af overførsel af elektroner fra donormolekyler i en række redoxreaktioner i ETC2. CoQ er det eneste redoxaktive lipid, der produceres endogent i alle cellemembraner og cirkulerende lipoproteiner, der viser antioxidantfunktion3. Det er en væsentlig bestanddel af ETC, der overfører elektroner fra NADH-afhængigt kompleks I og FADH2-afhængigt kompleks II til kompleks III, selvom mange andre reduktaser kan drive reduktionen af mitokondriel CoQ til ubiquinol som et obligatorisk trin i flere cellulære metaboliske veje4,5.
Gennem hele processen skabes en elektrokemisk protongradient på tværs af den mitokondrielle indre membran, som omdannes til biologisk aktiv energi af ATP-syntasekomplekset V2. Derfor fører mitokondriel dysfunktion til et utal af patologiske tilstande, der hovedsageligt påvirker væv med høje energibehov – hjernen, hjertet og skeletmuskulaturen6,7. Derfor er det grundlæggende at udvikle metoder til nøjagtigt at analysere mitokondriel bioenergetik for at undersøge dens rolle i sundhed og sygdom, især i meget energiske væv som skeletmuskler.
Oxygenelektroden af Clark-typen er klassisk blevet anvendt i studiet af mitokondriel respiration8. Dette system er imidlertid gradvist blevet fortrængt af teknologier med højere opløsning, hvor mikropladebaserede iltforbrugsteknologier som Agilent Seahorse XF-analysatorer er særligt populære9. På skeletmuskelområdet udføres disse undersøgelser typisk i dyrkede celler, hovedsageligt i C2C12 udødeliggjort muse myoblast cellelinje eller primære kulturer afledt af satellitceller10,11. Disse undersøgelser rekapitulerer imidlertid ikke fuldt ud situationen in vivo, især når man undersøger mitokondriebiologi og funktion på vævsniveau ved specifikke fornærmelser, ikke-genetiske indgreb eller genetiske manipulationer.
Desuden er respirationsassays i celler mere komplekse på grund af yderligere faktorer, herunder ekstra mitokondriel efterspørgsel efter ATP- og assaysubstrater eller signalhændelser, hvilket kan vildlede fortolkningen af resultaterne. Alternativt er det også muligt at bruge enkelt eller bundter af friskisolerede myofibre fra musklerne. Isolationsmetoden er dog teknisk udfordrende og kun mulig for nogle få muskeltyper. I dette tilfælde anvendes flexor digitorum brevis (FDB) og extensor digitorum longus (EDL) muskler hovedsageligt10,12,13, selvom nogle få rapporter også beskriver brugen af andre muskeltyper14,15.
Bioenergetisk profilering af skeletmuskelsektioner er også blevet rapporteret16. Den største fordel ved denne metode er, at intakte muskler kan studeres (forfatterne viser, at udskæring gennem fibre ikke forstyrrer resultaterne sammenlignet med isolerede myofibre). Mitokondrieadgangen til substrater og analysehæmmere er dog begrænset, og dermed kan kun få parametre måles16. Endelig kan isolerede mitokondrier ligeledes anvendes9,17,18,19. I dette tilfælde mister mitokondrier deres cytosoliske miljø, hvilket kan påvirke deres funktion. I modsætning hertil garanterer denne metode adgang til substrater og hæmmere, muliggør analyse af en overflod af prøvetyper og kræver typisk mindre materiale.
Dette papir beskriver en metode til at udføre bioenergetisk profilering af isolerede mitokondrier fra museskeletmuskulatur ved hjælp af mikropladebaserede respirometriske assays (figur 1). Der er navnlig tre protokoller detaljeret: koblingsassayet, CA til vurdering af graden af kobling mellem etc og OXPHOS-maskinen; Elektronstrømsassayet, EFA til måling af aktiviteten af de enkelte ETC-komplekser; og BOX-analysen til bestemmelse af mitokondrie- β oxidationskapacitet. Især kræves der kun små mængder prøver sammenlignet med konventionelle respirometrimetoder. Den isolationsprotokol, der anvendes her, er blevet ændret fra den metode, der er offentliggjort andetsteds18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle metoder, der anvendes til at studere mitokondriel respiration, har deres begrænsninger; Derfor er det afgørende at vælge den metode, der bedst passer til et specifikt eksperimentelt spørgsmål. Dette arbejde giver en opdateret og detaljeret protokol til at isolere mitokondrier fra musens skeletmuskulatur for at udføre forskellige respiratoriske assays for at undersøge mitokondriefunktionen. Faktisk er undersøgelsen af mitokondriel bioenergetik i isolerede mitokondrier ved hjælp af mikropladebaserede teknolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Juan J. Tena for brugen af homogenisatoren og CABD Proteomics and Animal Husbandry-faciliteterne til teknisk support. Dette arbejde blev støttet af det spanske ministerium for uddannelse, kultur og sport gennem stipendium FPU16/03264 til J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) gennem stipendietilskud #22450 til C.V.-G., et institutionelt tilskud MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) og BFU2017-83150-P til J.J.C. Junta de Andalucía-bevillingen P18-RT-4572, FEDER-finansieringsprogrammet fra Den Europæiske Union og det spanske ministerium for videnskab, innovation og universiteter giver RED2018-102576-T til P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
