Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays
Summary
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.
Abstract
Der größte Teil der Energie der Zelle wird durch den Abbau von Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren über verschiedene Wege gewonnen, die auf dem mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystem (OXPHOS) zusammenlaufen, das als Reaktion auf zelluläre Anforderungen reguliert wird. Das Lipidmolekül Coenzym Q (CoQ) ist in diesem Prozess essentiell, indem es Elektronen durch konstante Oxidations- / Reduktionszyklen in den Komplex III in der Elektronentransportkette (ETC) überträgt. Der Zustand der Mitochondrien und letztendlich die Zellgesundheit können durch Messung des ETC-Sauerstoffverbrauchs mithilfe von respirometrischen Assays beurteilt werden. Diese Studien werden typischerweise in etablierten oder primären Zelllinien durchgeführt, die mehrere Tage lang kultiviert wurden. In beiden Fällen können die erhaltenen Atmungsparameter von den normalen physiologischen Bedingungen in einem bestimmten Organ oder Gewebe abgewichen sein.
Darüber hinaus behindern die intrinsischen Eigenschaften von kultivierten Einzelfasern, die aus der Skelettmuskulatur isoliert wurden, diese Art der Analyse. Dieses Papier stellt ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll für die Analyse der Atmung in frisch isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus vor. Wir bieten auch Lösungen für potenzielle Probleme, die in jedem Schritt des Prozesses auftreten können. Die hier vorgestellte Methode könnte angewendet werden, um Sauerstoffverbrauchsraten in verschiedenen transgenen Mausmodellen zu vergleichen und die mitochondriale Reaktion auf medikamentöse Behandlungen oder andere Faktoren wie Altern oder Geschlecht zu untersuchen. Dies ist eine praktikable Methode, um auf entscheidende Fragen zum mitochondrialen bioenergetischen Stoffwechsel und zur Regulation zu antworten.
Introduction
Mitochondrien sind die primären Stoffwechselorganellen in der Zelle1. Diese spezialisierten membranumschlossenen Organellen verwenden Nährstoffmoleküle, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) von OXPHOS zu erzeugen. Dieser Prozess beruht auf dem Transfer von Elektronen aus Donormolekülen in einer Reihe von Redoxreaktionen im ETC2. CoQ ist das einzige redoxaktive Lipid, das endogen in allen Zellmembranen und zirkulierenden Lipoproteinen produziert wird und eine antioxidative Funktion zeigt3. Es ist ein wesentlicher Bestandteil des ETC und überträgt Elektronen vom NADH-abhängigen Komplex I und FADH2-abhängigen Komplex II auf den Komplex III, obwohl viele andere Reduktasen die Reduktion von mitochondrialem CoQ zu Ubiquinol als obligatorischen Schritt in mehreren zellulären Stoffwechselwegen vorantreiben können4,5.
Während des gesamten Prozesses wird ein elektrochemischer Protonengradient über die mitochondriale innere Membran erzeugt, der durch den ATP-Synthasekomplex V2 in biologisch aktive Energie umgewandelt wird. Folglich führt die mitochondriale Dysfunktion zu einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, die hauptsächlich Gewebe mit hohem Energiebedarf betreffen – Gehirn, Herz und Skelettmuskulatur6,7. Daher ist es von grundlegender Bedeutung, Methoden zur genauen Analyse der mitochondrialen Bioenergetik zu entwickeln, um ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, insbesondere in hochenergetischen Geweben wie der Skelettmuskulatur.
Die Clark-Sauerstoffelektrode wurde klassischerweise bei der Untersuchung der mitochondrialen Atmung8 verwendet. Dieses System wurde jedoch zunehmend durch Technologien mit höherer Auflösung ersetzt, wobei mikroplattenbasierte Sauerstoffverbrauchstechnologien wie Agilent Seahorse XF-Analysatoren besonders beliebt sind9. Im Bereich der Skelettmuskulatur werden diese Studien typischerweise in kultivierten Zellen durchgeführt, hauptsächlich in der C2C12-immortalisierten Maus-Myoblasten-Zelllinie oder Primärkulturen, die von Satellitenzellen abgeleitet wurden10,11. Diese Studien rekapitulieren die Situation jedoch nicht vollständig in vivo, insbesondere bei der Untersuchung der mitochondrialen Biologie und der Funktion auf Gewebeebene bei spezifischen Beleidigungen, nichtgenetischen Eingriffen oder genetischen Manipulationen.
Darüber hinaus sind die Atmungstests in Zellen aufgrund zusätzlicher Faktoren komplexer, einschließlich des extramitochondrialen Bedarfs an ATP- und Assay-Substraten oder Signalereignissen, die die Interpretation der Ergebnisse in die Irre führen könnten. Alternativ ist es auch möglich, einzelne oder Bündel von frisch isolierten Myofasern aus Muskeln zu verwenden. Die Isolationsmethode ist jedoch technisch anspruchsvoll und nur für wenige Muskeltypen machbar. In diesem Fall werden hauptsächlich die Muskeln Flexor digitorum brevis (FDB) und Extensor digitorum longus (EDL) verwendet10,12,13, obwohl einige Berichte auch die Verwendung anderer Muskeltypen beschreiben14,15.
Eine bioenergetische Profilierung von Skelettmuskelabschnitten wurde ebenfalls berichtet16. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass intakte Muskeln untersucht werden können (die Autoren zeigen, dass das Durchschneiden von Fasern die Ergebnisse im Vergleich zu isolierten Myofasern nicht stört). Der mitochondriale Zugang zu Substraten und Assay-Inhibitoren ist jedoch begrenzt, so dass nur wenige Parameter gemessen werden können16. Schließlich können auch isolierte Mitochondrien eingesetzt werden9,17,18,19. In diesem Fall verlieren Mitochondrien ihre zytosolische Umgebung, was ihre Funktion beeinträchtigen könnte. Im Gegensatz dazu garantiert diese Methode den Zugang zu Substraten und Inhibitoren, ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Probentypen und benötigt typischerweise weniger Material.
Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Durchführung der bioenergetischen Profilierung von isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays (Abbildung 1). Insbesondere werden drei Protokolle detailliert beschrieben: der Coupling Assay, CA zur Beurteilung des Grades der Kopplung zwischen der ETC- und der OXPHOS-Maschine; der Elektronenfluss-Assay, EFA zur Messung der Aktivität der einzelnen ETC-Komplexe; und der BOX-Assay zur Bestimmung der mitochondrialen β-Oxidationskapazität. Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Respirometrie nur geringe Mengen an Proben benötigt werden. Das hier verwendete Isolationsprotokoll wurde gegenüber der an anderer Stelle veröffentlichten Methode geändert18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle Methoden, die zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, haben ihre Grenzen; Daher ist es entscheidend, die Methode auszuwählen, die am besten zu einer bestimmten experimentellen Fragestellung passt. Diese Arbeit bietet ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus, um verschiedene Atemassays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion durchzuführen. Tatsächlich ist die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik in isolie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Juan J. Tena für den Einsatz des Homogenisators und der CABD Proteomics and Animal Husbandry Einrichtungen für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Bildung, Kultur und Sport durch ein Stipendium FPU16/03264 an J.D.H.C., die Association Française contre les Myopathies (AFM) durch Fellowship Grant #22450 an C.V.-G., ein Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) und BFU2017-83150-P an J.J.C unterstützt. Der Junta de Andalucía-Zuschuss P18-RT-4572, das RENDER-Förderprogramm der Europäischen Union und das spanische Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten gewähren RED2018-102576-T an P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
Riferimenti
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