בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.
Abstract
רוב האנרגיה של התא מתקבלת באמצעות השפלה של גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו על ידי מסלולים שונים המתכנסים על מערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS), אשר מוסדר בתגובה לדרישות הסלולר. מולקולת השומנים קואנזים Q (CoQ) חיונית בתהליך זה על ידי העברת אלקטרונים ל- III מורכב בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) באמצעות מחזורי חמצון/הפחתה קבועים. מצב המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, בריאות התא ניתן להעריך על ידי מדידת צריכת חמצן ETC באמצעות בדיקות respirometric. מחקרים אלה מבוצעים בדרך כלל בשורות תא מבוססות או ראשוניות אשר היו בתרבית במשך מספר ימים. בשני המקרים, הפרמטרים של הנשימה שהושגו עשויים לסטות ממצבים פיזיולוגיים רגילים בכל איבר או רקמה נתון.
בנוסף, המאפיינים המהותיים של סיבים בודדים מתורבתים המבודדים משרירי השלד מעכבים סוג זה של ניתוח. מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן ומפורט לניתוח נשימה במיטוכונדריה מבודדת טרייה משריר השלד של העכבר. אנו מספקים גם פתרונות לבעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר בכל שלב של התהליך. השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעורי צריכת החמצן במודלים שונים של עכבר מהונדס וללמוד את התגובה המיטוכונדריאלית לטיפולים תרופתיים או גורמים אחרים כגון הזדקנות או מין. זוהי שיטה אפשרית להגיב לשאלות מכריעות על חילוף החומרים והרגולציה הביו-אנרגטית המיטוכונדריאלית.
Introduction
המיטוכונדריה הם האברונים המטבוליים העיקריים בתא1. אברונים מיוחדים אלה סגורים ממברנה להשתמש במולקולות מזין כדי לייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) על ידי OXPHOS. תהליך זה מסתמך על העברת אלקטרונים ממולקולות תורמות בסדרה של תגובות redox ב ETC2. CoQ הוא השומנים הפעילים היחידים המיוצרים באופן אנדוגני בכל הקרומים התאיים וליפופרוטאינים במחזור שמראה תפקוד נוגד חמצון3. זהו מרכיב חיוני של ETC, העברת אלקטרונים מ NADH תלוי קומפלקס I ו FADH2 תלוי קומפלקס II מורכב מורכב III מורכב, אם כי צמצומים רבים אחרים יכולים להניע את ההפחתה של CoQ מיטוכונדריאלי ליוביקינול כצעד חובה במסלולים מטבוליים תאיים מרובים4,5.
לאורך כל התהליך, שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי נוצר על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית, אשר הופכת לאנרגיה פעילה ביולוגית על ידי V2 קומפלקס סינתאז ATP. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למספר עצום של מצבים פתולוגיים המשפיעים בעיקר על רקמות עם דרישות אנרגיה גבוהה – המוח, הלב, ושרירי השלד6,7. לכן, זה בסיסי לפתח שיטות לנתח במדויק ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית כדי לחקור את תפקידה בבריאות ובמחלות, במיוחד ברקמות אנרגטיות מאוד כגון שרירי השלד.
אלקטרודת חמצן מסוג קלארק שימשה באופן קלאסי במחקר של נשימה מיטוכונדריאלית8. עם זאת, מערכת זו נעקרה בהדרגה על ידי טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה יותר, עם טכנולוגיות צריכת חמצן מבוססות מיקרופלט כגון מנתחי סוסון ים XF Agilent להיות פופולרי במיוחד9. בשדה שרירי השלד, מחקרים אלה מתנהלים בדרך כלל בתאים מתורבתים, בעיקר בקו התאים של העכבר המונצח C2C12 או בתרביות ראשוניות שמקורן בתאי לווין10,11. עם זאת, מחקרים אלה אינם מסכמים באופן מלא את המצב ב- vivo, במיוחד כאשר חוקרים ביולוגיה מיטוכונדריאלית ותפקוד ברמת הרקמה על עלבונות ספציפיים, התערבויות לא גנטיות או מניפולציות גנטיות.
יתר על כן, בדיקות נשימה בתאים מורכבות יותר בשל גורמים נוספים, כולל דרישה חוץ-מיטוכונדריאלית של ATP ומצעים לבדיקה או אירועי איתות, אשר עלול להטעות את הפרשנות של התוצאות. לחלופין, ניתן גם להשתמש יחיד או חבילות של myofibers מבודד טרי מן השרירים. עם זאת, שיטת הבידוד מאתגרת מבחינה טכנית ואפשרית רק עבור כמה סוגי שרירים. במקרה זה, flexor digitorum brevis (FDB) ו- extensor digitorum longus השרירים (EDL) משמשים בעיקר 10,12,13, אם כי כמה דיווחים מתארים את השימוש בסוגי שרירים אחרים, כמו גם 14,15.
פרופיל ביו-אנרגטי של מקטעי שרירי שלד דווח גם הוא16. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי שרירים שלמים ניתן ללמוד (המחברים מראים כי חיתוך דרך סיבים אינו מפריע לתוצאות בהשוואה myofibers מבודד). עם זאת, הגישה המיטוכונדריאלית למצעים ומעכבי בדיקה מוגבלת, ולכן, רק כמה פרמטרים ניתן למדוד16. לבסוף, מיטוכונדריה מבודדת יכולה להיות מועסקת גם 9,17,18,19. במקרה זה, המיטוכונדריה מאבדת את הסביבה הציטוטוסולית שלהם, מה שעלול להשפיע על תפקודם. לעומת זאת, שיטה זו מבטיחה גישה למצעים ומעכבים, מאפשרת ניתוח של שפע של סוגי מדגמים, ובדרך כלל דורשת פחות חומר.
מאמר זה מתאר שיטה לביצוע הפרופיל הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה המבודדת משריר השלד של העכבר באמצעות בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרופלסטיק (איור 1). בפרט, שלושה פרוטוקולים מפורטים: בדיקת צימוד, CA כדי להעריך את מידת הצימוד בין ETC ומכונות OXPHOS; אסאי זרימת האלקטרונים, EFA כדי למדוד את הפעילות של מתחמי ETC בודדים; ואת הבדיקה BOX כדי לקבוע את יכולת חמצון β מיטוכונדריאלי. ראוי לציין, רק כמויות קטנות של דגימות נדרשות בהשוואה לשיטות נשימה קונבנציונליות. פרוטוקול הבידוד המשמש כאן שונה מהשיטה שפורסמה במקום אחר18.
Protocol
Representative Results
Discussion
לכל השיטות המשמשות לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית יש מגבלות; לפיכך, חשוב לבחור את השיטה המתאימה ביותר לשאלה ניסיונית ספציפית. עבודה זו מספקת פרוטוקול מעודכן ומפורט כדי לבודד את המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר כדי לבצע בדיקות נשימה שונות כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה. ואכן, המחקר של ביו-א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לחואן ג’יי טנה על השימוש בהומוגניזר ובמתקני הפרוטאומיקה של CABD וגידול בעלי חיים על תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות והספורט הספרדי באמצעות מלגה FPU16/03264 ל- J.D.H.C., האגודה Française contre les Myopathies (AFM) באמצעות מענק מלגה #22450 ל- C.V.-G., מענק מוסדי MDM-2016-0687 (יחידת המצוינות מריה דה מאזטו, המחלקה לרגולציה גנטית ומורפוגנזה ב- CABD) ו- BFU2017-83150-P ל- J.J.C. מענק החונטה דה אנדלוסיה P18-RT-4572, תוכנית המימון של FEDER מהאיחוד האירופי, ומשרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי מעניקים RED2018-102576-T ל- P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
