Method Article

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

DOI:

10.3791/63336

⸱

February 10th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maggior parte dell'energia della cellula è ottenuta attraverso la degradazione di glucosio, acidi grassi e amminoacidi da diversi percorsi che convergono sul sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS), che è regolato in risposta alle richieste cellulari. La molecola lipidica Coenzima Q (CoQ) è essenziale in questo processo trasferendo elettroni al complesso III nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) attraverso cicli di ossidazione/riduzione costanti. Lo stato dei mitocondri e, in definitiva, la salute cellulare possono essere valutati misurando il consumo di ossigeno ETC utilizzando saggi respirometrici. Questi studi vengono in genere eseguiti in linee cellulari stabilite o primarie che sono state coltivate per diversi giorni. In entrambi i casi, i parametri respiratori ottenuti possono aver deviato dalle normali condizioni fisiologiche in un dato organo o tessuto.

Inoltre, le caratteristiche intrinseche delle singole fibre coltivate isolate dal muscolo scheletrico impediscono questo tipo di analisi. Questo documento presenta un protocollo aggiornato e dettagliato per l'analisi della respirazione nei mitocondri appena isolati dal muscolo scheletrico del topo. Forniamo anche soluzioni a potenziali problemi che potrebbero sorgere in qualsiasi fase del processo. Il metodo qui presentato potrebbe essere applicato per confrontare i tassi di consumo di ossigeno in diversi modelli murini transgenici e studiare la risposta mitocondriale ai trattamenti farmacologici o ad altri fattori come l'invecchiamento o il sesso. Questo è un metodo fattibile per rispondere a domande cruciali sul metabolismo e la regolazione della bioenergetica mitocondriale.

Introduction

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I mitocondri sono i principali organelli metabolici nella cellula1. Questi organelli specializzati racchiusi in membrana utilizzano molecole nutritive per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) da OXPHOS. Questo processo si basa sul trasferimento di elettroni da molecole donatrici in una serie di reazioni redox nell'ETC2. Il CoQ è l'unico lipide redox-attivo prodotto endogenamente in tutte le membrane cellulari e nelle lipoproteine circolanti che mostra una funzione antiossidante3. È un componente essenziale dell'ETC, trasferendo elettroni dal complesso I dipendente dal NADH e ....

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Protocol

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L'alloggiamento del topo e la raccolta dei tessuti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal Comitato Etico dell'Universidad Pablo de Olavide (Siviglia, Spagna; protocolli 24/04/2018/056 e 12/03/2021/033) in conformità con il Regio Decreto Spagnolo 53/2013, la Direttiva Europea 2010/63/UE e altre linee guida pertinenti.

1. Preparazione delle scorte, dei tamponi e dei reagenti per i saggi respiratori

  1. Preparare le seguenti soluzioni stock, che possono essere conservate alla temperatura indicata per mesi. Utilizzare H2O ultrapuro in tutti i casi.
    1. Sciogliere le compresse saline tampon....

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Results

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Il protocollo qui presentato consente l'analisi in vivo della respirazione mitocondriale attraverso l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo. Una descrizione del metodo è illustrata nella Figura 1. Dopo aver sezionato i muscoli scheletrici dagli arti posteriori (Figura 2), i tessuti vengono omogeneizzati e i mitocondri purificati, in condizioni isotoniche, attraverso centrifugazioni seriali. La purezza delle diverse frazioni ottenute.......

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Discussion

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Tutti i metodi utilizzati per studiare la respirazione mitocondriale hanno i loro limiti; quindi, è fondamentale selezionare il metodo che meglio si adatta a una specifica domanda sperimentale. Questo lavoro fornisce un protocollo aggiornato e dettagliato per isolare i mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per eseguire diversi saggi respiratori per studiare la funzione mitocondriale. In effetti, lo studio della bioenergetica mitocondriale nei mitocondri isolati utilizzando tecnologie basate su micropiastre è prezio.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgements

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Desideriamo ringraziare Juan J. Tena per l'uso dell'omogeneizzatore e le strutture CABD Proteomics and Animal Husbandry per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero spagnolo dell'Istruzione, della Cultura e dello Sport attraverso la borsa di studio FPU16/03264 a J.D.H.C., l'Associazione Française contre les Miopatie (AFM) attraverso la borsa di studio #22450 a C.V.-G., una sovvenzione istituzionale MDM-2016-0687 (Unità di eccellenza Maria de Maeztu, Dipartimento di regolazione genica e morfogenesi presso CABD) e BFU2017-83150-P a J.J.C. La sovvenzione della Junta de Andalucía P18-RT-4572, il programma di finanziamento FEDER dell'Unione europe....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA5285Stock a -20 ° C
AKT anticorpoCell Signaling TechnologyC67E7Coniglio (Specie ospite)
anti-capra HRPSigma401504Coniglio (Specie ospite)
anti-topo HRPCell Signaling#7076Cavallo (Specie ospite)
Antimicina ASigmaA8674Stock a -20 ° C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074Capra (Specie ospite)
Acido ascorbicoSigmaA5960Stock at RT
Tactina anticorpoSigmaMBS4-48085Capra (Specie ospite)
Kit di analisi delle proteine Bio-Rad IIBio-Rad5000002Include 5x reagente Bradford e BSA di concentrazione nota per la curva standard
BSA, frazione V, Calbiochem126575 brodo a 4 gradi C
C tuboMiltenyi Biotec130-093-237Coperchio viola
Anticorpo CalnexinThermoFisherMA3-027Topo (Specie ospite)
D-mannitoloSigmaM4125Stock a RT
EDTABDH280254DStock a 4 ° C
EGTASigmaE-4378Stock presso RT
FCCPSigmaC2920Stock a -20 ° C
gentleMACS DissociatoreMiltenyi Biotec130-093-235Omogeneizzatore
HEPESSigmaH3375Stock a RT
HSP70 anticorpoProteintech10995-1-APConiglio (Specie ospite)
Anticorpo LDH-ASanta Cruz BiotechnologySC27230Capra (Specie ospite)
Cloruro di magnesioChemCruzsc-255260AStock presso RT
Acido malicoSigmaP1645Stock presso RT
Spettrofotometro per micropiastreBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Stock presso RT
Milli-Q acquaSistema di milliporiF7HA17757AAcqua ultrapura
anticorpo mtTFASanta Cruz BiotechnologySC23588Capra (Specie ospite)
Na+/K+-ATPasi & alfa; 1 anticorpoNovus BiologicalsNB300-14755Topo (Specie ospite)
OligomicinaSigmaO4876Stock a -20 ° C
Palmitoil-L-carnitinaSigmaP1645Stock a -20 ° C
PBS compresseSigmaP4417-100TAB1x stock presso RT
Potassio diidrogeno fosfatoChemCruzsc-203211Stock presso RT
Idrossido di potassioSigma60377Stock presso RT
Acido piruvicoSigma107360Stock a 4 ° C
RotenoneSigmaR8875Stock a -20 ° C
Analizzatore di flusso mitocondriale Seahorse XF24Agilent Technologies420179modello XFe24
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100Il kit include cartucce, micropiastre e soluzione calibrante
SuccinatoSigmaS7626Stock presso RT
SaccarosioSigmaS9378Stock presso RT
TIMM23 anticorpoAbcamab230253Coniglio (Specie ospite)
TMPDSigmaT7394Stock a -20 ° C
TOMM20 anticorpoAbcamab56783Topo (Specie ospite)
VDAC anticorpoAbcamab15895Coniglio (Specie ospite)
senza acidi grassi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  3. Turunen, M.....

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Mitochondria IsolationSkeletal MuscleRespirometric AssaysOxygen ConsumptionElectron Transport ChainMitochondrial RespirationSerial CentrifugationProtein QuantificationBlue Native ElectrophoresisMitochondrial Membrane Markers

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