Isolering av mitokondrier från musskelettmuskel för respirometriska analyser
Summary
Här beskriver vi en detaljerad metod för mitokondriisolering från musskelettmuskeln och den efterföljande analysen av andning med oxygen consumption rate (OCR) med hjälp av mikroplattbaserade respirometriska analyser. Denna pipeline kan tillämpas för att studera effekterna av flera miljömässiga eller genetiska ingrepp på mitokondriell metabolism.
Abstract
Det mesta av cellens energi erhålls genom nedbrytning av glukos, fettsyror och aminosyror genom olika vägar som konvergerar på mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) -systemet, som regleras som svar på cellulära krav. Lipidmolekylen Koenzym Q (CoQ) är väsentlig i denna process genom att överföra elektroner till komplex III i elektrontransportkedjan (ETC) genom konstanta oxidations- / reduktionscykler. Mitokondriernas status och i slutändan cellulär hälsa kan bedömas genom att mäta ETC-syreförbrukning med hjälp av respirometriska analyser. Dessa studier utförs vanligtvis i etablerade eller primära cellinjer som har odlats i flera dagar. I båda fallen kan de erhållna andningsparametrarna ha avvikit från normala fysiologiska förhållanden i ett givet organ eller vävnad.
Dessutom hindrar de inneboende egenskaperna hos odlade enskilda fibrer isolerade från skelettmuskeln denna typ av analys. Detta dokument presenterar ett uppdaterat och detaljerat protokoll för analys av andning i nyligen isolerade mitokondrier från musskelettmuskeln. Vi tillhandahåller också lösningar på potentiella problem som kan uppstå när som helst i processen. Metoden som presenteras här kan tillämpas för att jämföra syreförbrukningshastigheter i olika transgena musmodeller och studera mitokondriellt svar på läkemedelsbehandlingar eller andra faktorer som åldrande eller kön. Detta är en genomförbar metod för att svara på avgörande frågor om mitokondriell bioenergetik metabolism och reglering.
Introduction
Mitokondrier är de primära metaboliska organellerna i cellen1. Dessa specialiserade membranslutna organeller använder näringsmolekyler för att producera energi i form av adenosintrifosfat (ATP) av OXPHOS. Denna process bygger på överföring av elektroner från givarmolekyler i en serie redoxreaktioner i ETC2. Q är den enda redoxaktiva lipiden som produceras endogent i alla cellulära membran och cirkulerande lipoproteiner som visar antioxidantfunktion3. Det är en väsentlig komponent i ETC, som överför elektroner från NADH-beroende komplex I och FADH2-beroende komplex II till komplex III, även om många andra reduktaser kan driva minskningen av mitokondriell q till ubiqinol som ett obligatoriskt steg i flera cellulära metaboliska vägar4,5.
Under hela processen skapas en elektrokemisk protongradient över det mitokondriella inre membranet, som omvandlas till biologiskt aktiv energi av ATP-syntaskomplexet V2. Följaktligen leder mitokondriell dysfunktion till en myriad av patologiska tillstånd som huvudsakligen påverkar vävnader med höga energibehov – hjärnan, hjärtat och skelettmuskeln6,7. Därför är det grundläggande att utveckla metoder för att noggrant analysera mitokondriella bioenergetik för att undersöka dess roll i hälsa och sjukdom, särskilt i mycket energiska vävnader som skelettmuskler.
Syreelektroden av Clark-typ har klassiskt använts i studien av mitokondriell andning8. Detta system har dock gradvis förskjutits av tekniker med högre upplösning, med mikroplattbaserad syreförbrukningsteknik som Agilent Seahorse XF-analysatorer som är särskilt populära9. Inom skelettmuskelfältet utförs dessa studier vanligtvis i odlade celler, främst i C2C12 odödliggjord mus myoblastcellinje eller primära kulturer härledda från satellitceller10,11. Dessa studier rekapitulerar emellertid inte helt situationen in vivo, särskilt när man undersöker mitokondriell biologi och funktion på vävnadsnivå vid specifika förolämpningar, icke-genetiska ingrepp eller genetiska manipulationer.
Dessutom är andningsanalyser i celler mer komplexa på grund av ytterligare faktorer, inklusive extramitokondriell efterfrågan på ATP- och analyssubstrat eller signalhändelser, vilket kan vilseleda tolkningen av resultaten. Alternativt är det också möjligt att använda singel eller buntar av nyisolerade myofibrer från muskler. Isoleringsmetoden är dock tekniskt utmanande och endast genomförbar för några få muskeltyper. I detta fall används flexor digitorum brevis (FDB) och extensor digitorum longus (EDL) muskler huvudsakligen10,12,13, även om några rapporter beskriver användningen av andra muskeltyper också14,15.
Bioenergetisk profilering av skelettmuskelsektioner har också rapporterats16. Den stora fördelen med denna metod är att intakta muskler kan studeras (författarna visar att skivning genom fibrer inte stör resultaten jämfört med isolerade myofibrer). Mitokondriell tillgång till substrat och analyshämmare är dock begränsad, och således kan endast ett fåtal parametrar mätas16. Slutligen kan isolerade mitokondrier också användas9,17,18,19. I detta fall förlorar mitokondrier sin cytosoliska miljö, vilket kan påverka deras funktion. Däremot garanterar denna metod tillgång till substrat och hämmare, möjliggör analys av en uppsjö av provtyper och kräver vanligtvis mindre material.
Denna uppsats beskriver en metod för att utföra bioenergetisk profilering av isolerade mitokondrier från musskelettmuskeln med hjälp av mikroplattbaserade respirometriska analyser (Figur 1). I synnerhet är tre protokoll detaljerade: kopplingsanalysen, CA för att bedöma graden av koppling mellan ETC och OXPHOS-maskinen; Elektronflödesanalysen, EFA för att mäta aktiviteten hos de enskilda ETC-komplexen. och BOX-analysen för att bestämma mitokondriell β oxidationskapacitet. I synnerhet krävs endast små mängder prover jämfört med konventionella respirometrimetoder. Isoleringsprotokollet som används här har modifierats från den metod som publicerats på annat håll18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alla metoder som används för att studera mitokondriell andning har sina begränsningar; Därför är det viktigt att välja den metod som bäst passar en specifik experimentell fråga. Detta arbete ger ett uppdaterat och detaljerat protokoll för att isolera mitokondrier från musskelettmuskeln för att utföra olika andningsanalyser för att undersöka mitokondriell funktion. Faktum är att studien av mitokondriell bioenergetik i isolerade mitokondrier med hjälp av mikroplattbaserad teknik är värdefull för att stu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Juan J. Tena för användningen av homogenisatorn och CABD Proteomics and Animal Husbandry-anläggningarna för teknisk support. Detta arbete stöddes av det spanska ministeriet för utbildning, kultur och sport genom stipendium FPU16/03264 till J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) genom stipendiebidrag #22450 till C.V.-G., ett institutionellt bidrag MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) och BFU2017-83150-P till JJ.C. Junta de Andalucía-bidraget P18-RT-4572, FEDER-finansieringsprogrammet från Europeiska unionen, och det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet beviljar RED2018-102576-T till P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
