Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu
Summary
Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.
Abstract
Hücrenin enerjisinin çoğu, glikozun, yağ asitlerinin ve amino asitlerin, hücresel taleplere yanıt olarak düzenlenen mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sistemi üzerinde birleşen farklı yollarla parçalanmasıyla elde edilir. Lipid molekülü Koenzim Q (CoQ), elektronları sabit oksidasyon/indirgeme döngüleri yoluyla elektron taşıma zincirindeki (ETM) kompleks III’e aktararak bu süreçte esastır. Mitokondri durumu ve nihayetinde hücresel sağlık, respirometrik testler kullanılarak ETC oksijen tüketiminin ölçülmesiyle değerlendirilebilir. Bu çalışmalar tipik olarak birkaç gündür kültürlenmiş yerleşik veya birincil hücre hatlarında gerçekleştirilir. Her iki durumda da, elde edilen solunum parametreleri, herhangi bir organ veya dokudaki normal fizyolojik koşullardan sapmış olabilir.
Ek olarak, iskelet kasından izole edilen kültürlenmiş tek liflerin içsel özellikleri bu tür analizleri engellemektedir. Bu yazıda, fare iskelet kasından yeni izole edilmiş mitokondrilerde solunumun analizi için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, sürecin herhangi bir adımında ortaya çıkabilecek potansiyel sorunlara da çözümler sunuyoruz. Burada sunulan yöntem, çeşitli transgenik fare modellerinde oksijen tüketim oranlarını karşılaştırmak ve ilaç tedavilerine veya yaşlanma veya cinsiyet gibi diğer faktörlere mitokondriyal yanıtı incelemek için uygulanabilir. Bu, mitokondriyal biyoenerjetik metabolizma ve düzenleme ile ilgili önemli sorulara cevap vermek için uygun bir yöntemdir.
Introduction
Mitokondri, hücredeki birincil metabolik organellerdir1. Bu özel membranla çevrili organeller, OXPHOS tarafından adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji üretmek için besin molekülleri kullanır. Bu süreç, ETC2’deki bir dizi redoks reaksiyonunda donör moleküllerden elektronların transferine dayanır. CoQ, tüm hücresel membranlarda endojen olarak üretilen ve antioksidan fonksiyon gösteren dolaşımdaki lipoproteinlerde bulunan tek redoks-aktif lipittir3. Elektronları NADH’ye bağımlı kompleks I ve FADH2’ye bağımlı kompleks II’den kompleks III’e aktaran ETM’nin önemli bir bileşenidir, ancak diğer birçok redüktaz, mitokondriyal CoQ’nun çoklu hücresel metabolik yollarda zorunlu bir adım olarak ubikinol’e indirgenmesini sağlayabilir4,5.
İşlem boyunca, ATP sentaz kompleksi V2 tarafından biyolojik olarak aktif enerjiye dönüştürülen mitokondriyal iç zar boyunca bir elektrokimyasal proton gradyanı oluşturulur. Sonuç olarak, mitokondriyal disfonksiyon, esas olarak yüksek enerji gereksinimi olan beyin, kalp ve iskelet kası gibi dokuları etkileyen sayısız patolojik duruma yol açar6,7. Bu nedenle, mitokondriyal biyoenerjetik maddeleri, özellikle iskelet kasları gibi yüksek enerjili dokularda, sağlık ve hastalıktaki rolünü araştırmak için doğru bir şekilde analiz etmek için yöntemler geliştirmek esastır.
Clark tipi oksijen elektrodu, mitokondriyal solunum çalışmasında klasik olarak kullanılmıştır8. Bununla birlikte, bu sistem giderek daha yüksek çözünürlüklü teknolojilerle yer değiştirmiştir ve Agilent Seahorse XF analizörleri gibi mikroplaka tabanlı oksijen tüketim teknolojileri özellikle popülerdir9. İskelet kası alanında, bu çalışmalar tipik olarak kültürlenmiş hücrelerde, özellikle C2C12 ölümsüzleştirilmiş fare miyoblast hücre hattında veya uydu hücrelerinden türetilen birincil kültürlerde gerçekleştirilir10,11. Bununla birlikte, bu çalışmalar, özellikle mitokondriyal biyolojiyi araştırırken ve belirli hakaretler, genetik olmayan müdahaleler veya genetik manipülasyonlar üzerine doku düzeyinde işlev görürken, durumu in vivo olarak tam olarak özetlememektedir.
Ayrıca, hücrelerdeki solunum tahlilleri, ATP’nin mitokondriyal olmayan talebi ve sonuçların yorumlanmasını yanlış yönlendirebilecek tahlil substratları veya sinyal olayları da dahil olmak üzere ek faktörler nedeniyle daha karmaşıktır. Alternatif olarak, kaslardan yeni izole edilmiş miyoliflerin tek veya demetlerini kullanmak da mümkündür. Bununla birlikte, izolasyon yöntemi teknik olarak zordur ve sadece birkaç kas tipi için uygulanabilir. Bu durumda, fleksör digitorum brevis (FDB) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kasları esas olarak kullanılır10,12,13, ancak birkaç rapor diğer kas tiplerinin kullanımını da açıklamaktadır14,15.
İskelet kası kesitlerinin biyoenerjetik profillemesi de bildirilmiştir16. Bu yöntemin en büyük avantajı, sağlam kasların çalışılabilmesidir (yazarlar, liflerden dilimlemenin, izole miyoliflerle karşılaştırıldığında sonuçları rahatsız etmediğini göstermektedir). Bununla birlikte, substratlara ve tahlil inhibitörlerine mitokondriyal erişim sınırlıdır ve bu nedenle sadece birkaç parametre ölçülebilir16. Son olarak, izole mitokondri de aynı şekilde kullanılabilir9,17,18,19. Bu durumda, mitokondri sitozolik ortamlarını kaybeder ve bu da işlevlerini etkileyebilir. Buna karşılık, bu yöntem substratlara ve inhibitörlere erişimi garanti eder, çok sayıda numune tipinin analizini sağlar ve tipik olarak daha az malzeme gerektirir.
Bu yazıda, mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak fare iskelet kasından izole edilmiş mitokondrinin biyoenerjetik profillemesini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Özellikle, üç protokol detaylandırılmıştır: ETC ve OXPHOS makineleri arasındaki bağlantı derecesini değerlendirmek için Kaplin Testi, CA; Elektron Akış Testi, bireysel ETC komplekslerinin aktivitesini ölçmek için EFA; ve mitokondriyal β-oksidasyon kapasitesini belirlemek için BOX testi. Özellikle, geleneksel respirometri yöntemlerine kıyasla sadece az miktarda numune gereklidir. Burada kullanılan yalıtım protokolü, başka bir yerde yayınlanan yöntemden değiştirilmiştir18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriyal solunumu incelemek için kullanılan tüm yöntemlerin sınırlamaları vardır; Bu nedenle, belirli bir deneysel soruya en uygun yöntemi seçmek çok önemlidir. Bu çalışma, mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için farklı solunum tahlilleri yapmak üzere mitokondrileri fare iskelet kasından izole etmek için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sağlar. Gerçekten de, mikroplaka bazlı teknolojiler kullanılarak izole mitokondride mitokondriyal biyoenerjetik çalışmaların incelenmesi, do…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Juan J. Tena’ya homojenizatörün kullanımı için ve teknik destek için CABD Proteomik ve Hayvancılık tesislerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, İspanya Eğitim, Kültür ve Spor Bakanlığı tarafından FPU16/03264 – J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) tarafından C.V.-G.’ye burs hibesi #22450, Kurumsal Hibe MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Mükemmellik Birimi, CABD’de Gen Düzenleme ve Morfogenez Bölümü) ve BFU2017-83150-P ile J.J.C’ye desteklenmiştir. Endülüs Cuntası, P18-RT-4572, Avrupa Birliği’nden FEDER Finansman Programı ve İspanya Bilim, İnovasyon ve Üniversiteler Bakanlığı RED2018-102576-T’yi P.N.’ye hibe ediyor.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
