लैंगेंडॉर्फ तैयारी में नवजात म्यूरिन हार्ट्स के उपयोग के लिए संशोधित तकनीक
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल महाधमनी कैनुलेशन और पूर्व विवो नवजात मूत्र हृदय के प्रतिगामी छिड़काव का वर्णन करता है। एक दो-व्यक्ति रणनीति, एक विदारक माइक्रोस्कोप और एक कुंद छोटी गेज सुई का उपयोग करके, विश्वसनीय कैनुलेशन की अनुमति देती है। अनुदैर्ध्य सिकुड़ा हुआ तनाव का परिमाणीकरण बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष से जुड़े बल ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है।
Abstract
पूर्व-विवो प्रतिगामी सुगंधित हृदय का उपयोग लंबे समय से इस्किमिया-रिपरफ्यूजन जांच की आधारशिला रहा है क्योंकि एक सदी पहले ऑस्कर लैंगेंडॉर्फ द्वारा इसके विकास के बाद से। यद्यपि इस तकनीक को पिछले 25 वर्षों में चूहों पर लागू किया गया है, लेकिन इस प्रजाति में इसका उपयोग वयस्क जानवरों तक सीमित रहा है। नवजात म्यूरिन महाधमनी को लगातार कैन्युलेट करने के लिए एक सफल विधि का विकास आनुवंशिक रूप से परिवर्तनीय और कम लागत वाली प्रजातियों में हृदय विकास की एक महत्वपूर्ण अवधि के दौरान पृथक प्रतिगामी सुगंधित हृदय के व्यवस्थित अध्ययन की अनुमति देगा। लैंगेंडॉर्फ तैयारी का संशोधन इस्केमिक समय को कम करते हुए नवजात मूत्र हृदय में कैनुलेशन और रिपरफ्यूजन की स्थापना को सक्षम बनाता है। अनुकूलन एक विदारक माइक्रोस्कोप और एक संशोधित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुई का उपयोग कर नवजात माउस महाधमनी के सफल कैनुलेशन की अनुमति देने के लिए एक दो व्यक्ति तकनीक की आवश्यकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मज़बूती से 3 मिनट के भीतर प्रतिगामी छिड़काव स्थापित करेगा। चूंकि नवजात माउस दिल और वेंट्रिकुलर गुहा आकार की नाजुकता एक गुब्बारे का उपयोग करके उत्पन्न इंट्रावेंट्रिकुलर दबाव के प्रत्यक्ष माप को रोकती है, इसलिए अनुदैर्ध्य सिकुड़ा हुआ तनाव को मापने के लिए बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष पर एक सिवनी द्वारा जुड़े बल ट्रांसड्यूसर का उपयोग आवश्यक है। यह विधि जांचकर्ताओं को एक पृथक निरंतर-प्रवाह प्रतिगामी-सुगंधित नवजात म्यूरिन हृदय तैयारी को सफलतापूर्वक स्थापित करने की अनुमति देती है, जिससे पूर्व-विवो तरीके से विकासात्मक हृदय जीव विज्ञान के अध्ययन की अनुमति मिलती है। महत्वपूर्ण रूप से, यह मॉडल नवजात हृदय में इस्किमिया-रिपरफ्यूजन के लिए शारीरिक और औषधीय प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होगा।
Introduction
पूर्व-विवो हृदय की तैयारी एक सदी से अधिक समय से शारीरिक, पैथोफिजियोलॉजिकल और फार्माकोलॉजिकल अध्ययनों का एक प्रधान रही है। 1860 के दशक में एलियास सायन के काम से उपजी, ऑस्कर लैंगेंडॉर्फ ने प्रतिगामी छिड़काव के लिए पृथक मेंढक मॉडल को अनुकूलित किया, महाधमनी जड़ को ऑक्सीजन युक्त इत्र1 के साथ कोरोनरी प्रवाह प्रदान करने के लिए दबाव डाला। अपने अनुकूलन का उपयोग करते हुए, लैंगेंडॉर्फ कोरोनरी परिसंचरण और यांत्रिक कार्य2 के बीच एक सहसंबंध प्रदर्शित करने में सक्षम था। पूर्व-विवो प्रतिगामी सुगंधित दिल, जिसे बाद में लैंगेंडॉर्फ तकनीक कहा जाता है, शारीरिक जांच की आधारशिला बनी हुई है, जो संभावित कंफाउंडर्स की अनुपस्थिति में पृथक हृदय का शक्तिशाली अध्ययन करने के लिए अपनी सादगी का लाभ उठाती है। लैंगेंडॉर्फ तैयारी को आगे संशोधित किया गया है ताकि दिल को बाहर निकालने की अनुमति मिल सके (तथाकथित “कामकाजी दिल”) और इत्र को पुन: परिचालित करने की अनुमतिदें 3. हालांकि, ब्याज के प्राथमिक शारीरिक समापन बिंदु अपरिवर्तित रहे हैं। इस तरह के समापन बिंदुओं में सिकुड़ा हुआ कार्य, विद्युत चालन, हृदय चयापचय और कोरोनरी प्रतिरोध के उपाय शामिलहैं 4.
अपने मूल मेंढक हृदय की तैयारी में कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए, लैंगेंडॉर्फ ने हृदय के शीर्ष और बल ट्रांसड्यूसर के बीच जुड़े सिवनी का उपयोग करके अनुदैर्ध्य अक्ष में वेंट्रिकुलर संकुचन द्वारा उत्पन्न तनाव को मापा। 5 वेंट्रिकुलर भरने की अनुपस्थिति में हृदय पर लागू बेसल तनाव के साथ आइसोमेट्रिक संकुचन को इस तरह से परिमाणित किया गया था। दृष्टिकोण के शोधन ने आइसोवोल्यूमिक संकुचन के दौरान मायोकार्डियल प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए बाएं आलिंद के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में द्रव से भरे गुब्बारे रखे हैं6. हृदय ताल और हृदय गति का आकलन करने के लिए, सतह की ओर ले जाने को हृदय के ध्रुवों पर रखा जा सकता है ताकि जांचकर्ता इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम रिकॉर्ड कर सकें। हालांकि, सापेक्ष ब्रैडीकार्डिया की उम्मीद की जा सकती है, अनिवार्य विकृति को देखते हुए। बाहरी पेसिंग इसे दूर करने और प्रयोगों के बीच हृदय गति परिवर्तनशीलता को खत्म करने के लिए काम कर सकता है1. एक अन्य परिणाम उपाय, मायोकार्डियल चयापचय, कोरोनरी इत्र और प्रवाह में ऑक्सीजन और चयापचय सब्सट्रेट सामग्री को मापने और उनके बीच अंतर की गणना करके मूल्यांकन किया जा सकताहै 7. कोरोनरी प्रवाह में लैक्टेट मात्रा का ठहराव अवायवीय चयापचय की अवधि को चिह्नित करने में सहायता कर सकता है जैसा कि हाइपोक्सिया, हाइपोपरफ्यूजन, इस्किमिया-रिपरफ्यूजन, या चयापचय गड़बड़ी के साथ देखा जाता है7.
लैंगेंडॉर्फ के मूल कार्य ने प्राथमिक विषय5 के रूप में बिल्लियों का उपयोग करते हुए, पूर्व-विवो स्तनधारी हृदय के अध्ययन को सक्षम किया। पृथक चूहे के दिल के मूल्यांकन ने 1900 के दशक के मध्य में लोकप्रियता हासिल की हॉवर्ड मॉर्गन, जिन्होंने 1967 में ‘वर्किंग हार्ट’ चूहा मॉडलका विवरण दिया। चूहों का उपयोग केवल 25 साल पहले तकनीकी जटिलता, ऊतक नाजुकता और अपेक्षाकृत छोटे मूत्र हृदय के आकार के कारण शुरू हुआ था। चूहों के अध्ययन से जुड़ी चुनौतियों के बावजूद, कम लागत और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी ने इस तरह के पूर्व-विवो तैयारी की अपील और मांग में वृद्धि की है। दुर्भाग्य से, तकनीक का अनुप्रयोग वयस्क जानवरों तक सीमित है, किशोर 4 सप्ताह के चूहों के साथ हाल ही में 8,9 तक पूर्व-विवो अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे कम उम्र के विषय हैं। जबकि किशोर चूहे वयस्कों की तुलना में “अपेक्षाकृत अपरिपक्व” हैं, विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए विषयों के रूप में उनकी उपयोगिता सीमित है क्योंकि वे बड़े पैमाने पर, अपने जन्म बांध से छुटकारा पा चुके हैं और जल्द ही यौवन10 शुरू करेंगे। किशोरावस्था ग्लूकोज और लैक्टेट से फैटी एसिड तक मायोकार्डियल सब्सट्रेट उपयोग में प्रसवोत्तर संक्रमण से परे अच्छी तरह से होती है11. इस प्रकार, नवजात हृदय में चयापचय परिवर्तनों के बारे में अधिकांश जानकारी ऐतिहासिक रूप से खरगोशों और गिनी पिग11 जैसी बड़ी प्रजातियों में पूर्व-विवो काम के परिणामस्वरूप हुई है।
दरअसल, लैंगेंडॉर्फ तैयारी के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूद हैं। इनमें इन विट्रो प्रयोग शामिल हैं, जिसमें पूरे अंग कार्यात्मक डेटा और संदर्भ का अभाव है, या विवो अध्ययन में। यह एक अपेक्षित संवेदनाहारी एजेंट के कार्डियोवैस्कुलर और श्वसन प्रभाव, न्यूरोह्यूमोरल इनपुट के प्रभाव, कोर तापमान के परिणाम, जानवर की पोषण संबंधी स्थिति और सब्सट्रेट उपलब्धता12,13 जैसे चर को भ्रमित करके तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और जटिल हो सकता है। क्योंकि लैंगेंडॉर्फ दृष्टिकोण इस तरह के कंफाउंडर्स की अनुपस्थिति में अधिक नियंत्रित तरीके से पूर्व-विवो तरीके से पृथक-सुगंधित हृदय के अध्ययन की अनुमति देता है, इसलिए इसे एक शक्तिशाली जांच उपकरण माना जाता है और जारी है। इसलिए, यहां प्रस्तुत तकनीक शोधकर्ताओं को नवजात मूत्र हृदय के पूर्व-विवो अध्ययन के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण देती है और पुनरावृत्ति के लिए समय को सीमित करती है।
विकास की अवधि के दौरान हृदय की जांच करना मायोकार्डियल परिपक्वता के दौरान होने वाले व्यापक जैव रासायनिक, शारीरिक और शारीरिक संक्रमण को देखते हुए एक महत्वपूर्ण विचार है। एनारोबिक चयापचय से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन में बदलाव, सब्सट्रेट उपयोग में परिवर्तन, और सेल प्रसार से अतिवृद्धि तक प्रगति गतिशील प्रक्रियाएं हैं जो विशिष्ट रूप से अपरिपक्व हृदय 11,14 में होती हैं। विकासशील हृदय का एक और महत्वपूर्ण पहलू यह है कि आवश्यक अवधि के दौरान सामना किए गए तनाव नवजात हृदय में बढ़ी हुई प्रतिक्रियाएं पैदा कर सकते हैं और वयस्कता15 में अपमान के लिए भविष्य की संवेदनशीलता को बदल सकते हैं। यद्यपि पूर्व कार्य ने लैंगेंडॉर्फ-सुगंधित नवजात हृदय का अध्ययन करने के लिए नवजात चूहों, भेड़ के बच्चे और खरगोशों का उपयोग किया है, चूहों के उपयोग की अनुमति देने वाली प्रगति विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान16 के लिए इस प्रजाति के महत्व को देखते हुए आवश्यक है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, 10-दिवसीय जानवरों का उपयोग करके पहला म्यूरिन लैंगेंडॉर्फ-सुगंधित नवजात हृदय मॉडल हाल ही में स्थापित किया गया था6. यहां प्रस्तुत सफल महाधमनी कैनुलेशन को सक्षम करने और पृथक नवजात शिशु मूत्र हृदय के प्रतिगामी छिड़काव की स्थापना करने की एक विधि है। इस दृष्टिकोण का उपयोग फार्माकोलॉजी, इस्किमिया-रिपरफ्यूजन, या पूरे अंग समारोह पर ध्यान केंद्रित करने वाले चयापचय अध्ययनों के लिए किया जा सकता है या कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान कार्य पृथक नवजात माउस दिल में सफल महाधमनी कैनुलेशन और प्रतिगामी छिड़काव का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह शोधकर्ताओं को उन बाधाओं को दूर करने की अनुमति देता है जो युवा उम्र और छोटे दिल के …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएनडीएस आर01एनएस112706 (आर.एल.)
Materials
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
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