Det föreliggande protokollet beskriver intracerebroventrikulär (ICV) injektion av vuxna zebrafiskar med neurotoxisk 6-hydroxigopamin (6-OHDA) vid ventral diencephalon (Dn) och bedömningen av försämringen och efterföljande återhämtning av simbeteendepostlesion genom att använda det öppna tanktestet, som åtföljs av analys med hjälp av en videospårningsprogramvara.
Begränsningarna av nuvarande behandlingar för att fördröja dopaminerg neuronal förlust vid Parkinsons sjukdom (PD) ökar behovet av alternativa terapier som kan återställa dessa neuroner. Mycket ansträngning riktas för närvarande mot en bättre förståelse av neuroregeneration med hjälp av prekliniska in vivo-modeller . Denna regenerativa förmåga till självreparation är dock ineffektiv hos däggdjur. Icke-däggdjursdjur som zebrafisk har således framträtt som en utmärkt neuroregenerativ modell på grund av dess förmåga att kontinuerligt självförnya och ha en nära hjärnhomologi till människor. Som en del av ansträngningen att belysa cellulära händelser som är involverade i neuroregenerering in vivo har vi etablerat den 6-hydroxydopamin (6-OHDA) -inducerade vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen. Detta uppnåddes genom den optimerade intracerebroventrikulära (ICV) mikroinjektionen av 99,96 mM 6-OHDA för att specifikt ablate dopaminerga neuroner (DpN) i ventral diencephalon (Dn) i zebrafiskhjärnan. Immunofluorescens indikerade mer än 85 % av DpN-ablationen vid dag tre efter förlossningen och fullständigt återställande av DpN vid lesionsstället 30 dagar efter förlossningen. Den föreliggande studien bestämde försämringen och efterföljande återhämtning av zebrafiskens simbeteende efter lesion genom att använda det öppna fälttestet genom vilket två parametrar, körd sträcka (cm) och medelhastighet (cm / s), kvantifierades. Förflyttningen bedömdes genom att analysera inspelningarna av enskilda fiskar i varje grupp (n = 6) med hjälp av videospårningsprogramvara. Resultaten visade en signifikant (p < 0,0001) minskning av hastighet (cm / s) och körd sträcka (cm) för lesionerad zebrafisk 3 dagar efter 3 dagar efter sham. Den lesionerade zebrafisken uppvisade full återhämtning av simbeteende 30 dagar efter böjningen. De nuvarande resultaten tyder på att 6-OHDA-lesionerad vuxen zebrafisk är en utmärkt modell med reproducerbar kvalitet för att underlätta studien av neuroregeneration i PD. Framtida studier om mekanismerna bakom neuroregenerering samt inneboende och yttre faktorer som modulerar processen kan ge viktig inblick i nya strategier för cellersättningsbehandling mot PD.
Parkinsons sjukdom (PD), en sjukdom som tydligt kännetecknas av muskelstyvhet, vilande tremor och bradykinesi, är den snabbast växande neurologiska sjukdomen i världen1,2. Risken och förekomsten av PD ökar snabbt med åldern, särskilt hos individer i åldern 50 år och äldre3. Etiologin och patogenesen av PD hittills är fortfarande dåligt förstådd. Detta har ofta lämnat den tidiga starten av PD odiagnostiserad. För närvarande är bristen på dopamin och förlusten av dopaminerga nervceller (DpN) hos PD-patienter starkt kopplade till manifestationen av motoriska symtom4. Genom att dra nytta av detta förhållande har flera behandlingar utformats antingen för att fungera direkt som dopaminersättning (dvs. levodopa) eller för att kompensera för förlusten av DpN (dvs. djup hjärnstimulering). Även om dessa behandlingar medför symtomatiska fördelar, ändrar de inte sjukdomsförloppets försämrade förlopp5. Mot bakgrund av denna betydande svaghet har cellersättningsterapi föreslagits. Effekten av detta tillvägagångssätt är emellertid inkonsekvent med tanke på utmaningarna med transplantatberedning, celltillväxtkontroll och fenotypinstabilitet. Cellersättningsterapi, som hade väckt etiska problem, utgör också risken för att inducera hjärntumörer och oönskade immunreaktioner6,7.
Begränsningarna i nuvarande terapeutiska strategier har lett till en större tonvikt på regenerering av DpN som ett potentiellt tillvägagångssätt vid behandling av PD. Regenerering av DpN eller neuroregeneration har framstått som ett av de lovande genombrotten i hanteringen av PD, inte bara på grund av dess potential som en ny terapeutisk metod utan också som medel för att förstå sjukdomsmekanismen8, 9. Detta tillvägagångssätt fokuserar på återställande av neuronal funktion genom differentiering, migration och integration av befintliga stamceller i de lesionerade kretsarna10. För att ytterligare utforska neuroregeneration har olika in vivo-studier genomförts. Det visade sig att ryggradsdjur som däggdjur, amfibier och reptiler genererar nya hjärnceller efter skada11,12. Bland ryggradsdjuren är däggdjursdjur mer eftertraktade med tanke på deras genetiska likhet med människor. Däggdjur uppvisar dock begränsad och dålig reparativ kapacitet i centrala nervsystemet (CNS) som kan pågå genom vuxen ålder efter en hjärnskada13. I allmänhet är däggdjur olämpliga som djurmodeller för att förstå neuroregenerering med tanke på att det låga antalet neuroner som produceras inte kommer att vara tillräckligt för att återställa skadade neurala kretsar som observerats vid PD. Som sådan är den teleostbaserade modellen, särskilt i zebrafisk, mycket gynnad för sin höga proliferativa hastighet, förmåga att kontinuerligt självförnya och stänga hjärnhomologi med människor14,15.
Zebrafisk används oftast för att studera oordnad rörelse i PD16. Den zebrafiskbaserade PD-modellen induceras vanligtvis av neurotoxiner, som inkluderar 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) och 6-hydroxydopamin (6-OHDA)17. Även om det är effektivt för att inducera specifik förlust av DpN och minskning av dopaminnivåer, efterliknar MPTP-baserade modeller inte nära villkoren för PD eftersom DpN-förlusten inte är begränsad enbart till CNS18. Oförmågan hos 6-OHDA att passera blod-hjärnbarriären begränsade dess effekter på cellulära och funktionella förändringar i hjärnan när det administreras intrakraniellt i motsats till intramuskulärt19. Perifer administrering av 6-OHDA orsakade en global minskning av dopaminnivåerna i hela nervsystemet20. Medan administrering av 6-OHDA i cerebrospinalvätskan orsakade ablation av DpN i hela CNS21, vilket inte efterliknar tillståndet som ses i PD varigenom förlusten av DpN uppträder specifikt vid substantia nigra i den mänskliga hjärnan. ICV-administrering av 6-OHDA, tvärtom, inducerade specifikt signifikant ablation av DpN i området ventral Dn i zebrafiskhjärnan, som liknade substantia nigra22. Intressant nog rapporterades återhämtning av DpN 30 dagar efter 6-OHDA-inducerad lesion och dessa neuroner överlevde under livet23,24. Den funktionella återhämtningen av DpN demonstrerades genom en lokomotorisk bedömning av tillryggalagd sträcka (cm) och medelhastighet (cm/s) med användning av den 6-OHDA-inducerade vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen22.
Det aktuella arbetet visade framgångsrikt den lokomotoriska bedömningen av den etablerade 6-OHDA-inducerade, vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen. Hela experimentet involverade tre huvudsteg: pre-ICV mikroinjektionspreparat, ICV-mikroinjektion av zebrafisk och lokomotorisk bedömning. För att säkerställa en hälsosam återhämtning av vuxna zebrafiskar efter ICV-mikroinjektionsförfarandet och goda experimentella resultat har vissa goda metoder för varje steg rekommenderats i den aktuella studien.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ministeriet för högre utbildning Malaysia inom ramen för systemet för bidrag till grundforskning [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials | |||
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
Equipment | |||
ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |