Bioinformatikresurser för studier av glykanmedierade proteininteraktioner

Summary

Detta protokoll illustrerar hur man utforskar, jämför och tolkar mänskliga proteinglykom med online-resurser.

Abstract

Initiativet Glyco@Expasy lanserades som en samling databaser och verktyg som är beroende av varandra och som spänner över flera aspekter av kunskap inom glykobiologi. I synnerhet syftar det till att belysa interaktioner mellan glykoproteiner (såsom cellytereceptorer) och kolhydratbindande proteiner medierade av glykaner. Här introduceras stora resurser i samlingen genom två illustrativa exempel centrerade på N-glykomet av det humana prostataspecifika antigenet (PSA) och O-glykomet av humana serumproteiner. Genom olika databasfrågor och med hjälp av visualiseringsverktyg visar den här artikeln hur du utforskar och jämför innehåll i ett kontinuum för att samla in och korrelera annars spridda bitar av information. Insamlade data är avsedda att mata mer detaljerade scenarier av glykanfunktion. Glycoinformatik som introduceras här föreslås därför som ett sätt att antingen stärka, forma eller motbevisa antaganden om specificiteten hos ett proteinglykom i ett givet sammanhang.

Introduction

Glykaner, proteiner till vilka de är fästa (glykoproteiner) och proteiner som de binder till (lektiner eller kolhydratbindande proteiner) är de viktigaste molekylära aktörerna vid ^cellytan1. Trots denna centrala roll i cell-cellkommunikation är storskaliga studier, inklusive glykomik, glykopreteomik eller glykan-interkomemitiska data fortfarande knappa jämfört med deras motsvarighet inom genomik och proteomik.

Fram till nyligen hade metoder för att karakterisera förgreningsstrukturerna hos komplexa kolhydrater medan de fortfarande konjugerades till bärarproteinet inte utvecklats. Biosyntesen av glykoproteiner är en icke-malldriven process där monosackariddonatorerna, de accepterande glykoproteinsubstraten och glykosyltransferaserna och glykosidaserna spelar en interaktiv roll. De resulterande glykoproteinerna kan bära komplexa strukturer med flera förgreningspunkter där varje monosackaridkomponent kan vara en av de flera typer som finns i ^naturen1. Den icke-malldrivna processen inför biokemisk analys som det enda alternativet för att generera oligosackaridstrukturdata. Analysprocessen för glykanstrukturer som är fästa vid ett inhemskt protein är ofta utmanande eftersom det kräver känslig, kvantitativ och robust teknik för att bestämma monosackaridkomposition, kopplingar och förgreningssekvenser2.

I detta sammanhang är masspektrometri (MS) den mest använda tekniken i glykomik- och glykopretogenomikexperiment. Med tiden utförs dessa i högre dataflödesinställningar och data ackumuleras nu i databaser. Glykanstrukturer i olika ^format3, fyll i GlyTouCan4, det universella glykandatalagret där varje struktur är associerad med en stabil identifierare oavsett vilken precisionsnivå glykanen definieras med (t.ex. eventuellt saknad länktyp eller tvetydig sammansättning). Mycket liknande strukturer samlas in men deras mindre skillnader rapporteras tydligt. Glykoproteiner beskrivs och kurateras i ^GlyConnect5 och GlyGen6, två databaser som korsrefererar varandra. MS-data som stöder strukturella bevis lagras alltmer i ^GlycoPOST7. För en bredare täckning av online-resurser är kapitel 52 i referenshandboken, Essentials of Glycobiology, tillägnad glycoinformatik8. Intressant nog har glykopeptididentifieringsprogramvara spridit sig de senaste ^åren9,10 men inte till förmån för reproducerbarhet. Den senare oron fick ledarna för HUPO GlycoProteomics Initiative (HGI) att ställa in en mjukvaruutmaning 2019. De MS-data som erhållits genom bearbetning av komplexa blandningar av N- och O-glykosylerade humana serumproteiner i fragmenteringslägena CID, ETD och EThcD, gjordes tillgängliga för konkurrenter, oavsett om det var programvaruanvändare eller utvecklare. Den fullständiga rapporten om resultaten av denna ^utmaning11 beskrivs bara här. Till att börja med observerades en spridning av identifikationer. Det tolkades främst som orsakat av mångfalden av metoder som implementerades i sökmotorer, av deras inställningar och hur utgångar filtrerades och peptid “räknades”. Den experimentella designen kan också ha satt viss programvara och tillvägagångssätt på en (o)fördel. Viktigt är att deltagare som använder samma programvara rapporterade inkonsekventa resultat och därmed belyste allvarliga reproducerbarhetsproblem. Det drogs slutsatsen genom att jämföra olika inlägg att vissa mjukvarulösningar fungerar bättre än andra och vissa sökstrategier ger bättre resultat. Denna återkoppling kommer sannolikt att vägleda förbättringen av automatiserade glykopeptiddataanalysmetoder och kommer i sin tur att påverka databasinnehållet.

Expansionen av glycoinformatik ledde till att skapa webbportaler som ger information och tillgång till flera liknande eller kompletterande resurser. De senaste och senaste beskrivs i ett kapitel i bokserien Omfattande glykovetenskap12 och genom samarbete erbjuds en lösning för datadelning och informationsutbyte i ett open access-läge. En sådan portal utvecklades som ursprungligen kallades Glycomics@ExPASy ¹³ och döptes om Glyco@Expasy, efter den stora översynen av Expasy-plattformen14 som har varit värd för en stor samling verktyg och databaser som används över flera -omics i årtionden, det mest populära objektet är UniProt15-den universella proteinkunskapsbasen. Glyco@Expasy erbjuder en didaktisk upptäckt av syftet med och användningen av databaser och verktyg, baserat på en visuell kategorisering och en visning av deras ömsesidiga beroenden. Följande protokoll illustrerar procedurer för att utforska glykomik- och glykoproteomikdata med ett urval av resurser från denna portal som gör sambandet mellan glykopreteomik och glykan-interkomik explicit via glykomik. Som det är, producerar glykomikexperiment strukturer där monosackarider är fullständigt definierade och kopplingar delvis eller helt bestämda, men deras proteinplatsbindning är dåligt, om alls, karakteriserad. Däremot genererar glykopreogenomikexperiment exakt information om platsbindning men med en dålig upplösning av glykanstrukturer, ofta begränsade till monosackaridkompositioner. Denna information är sammansatt i GlyConnect-databasen. Dessutom kan sökverktyg i GlyConnect användas för att detektera potentiella glykanligander som beskrivs tillsammans med proteinerna som känner igen dem i UniLectin16, kopplade till GlyConnect via glykaner. Protokollet som presenteras här är uppdelat i två avsnitt för att täcka frågor som är specifika för N-länkade och O-länkade glykaner och glykoproteiner.

Protocol

OBS: En enhet med en internetanslutning (större skärm föredras) och en uppdaterad webbläsare som Chrome eller Firefox krävs. Att använda Safari eller Edge kanske inte är lika tillförlitligt. 1. Från ett protein N-glykom i GlyConnect till ett lektin av UniLectin Åtkomst till resurser från Glyco@ExpasyOBS: Proceduren som beskrivs här är att komma åt GlyConnect men kan tillämpas på åtkomst till alla resurser som registrerats på pla…

Representative Results

Den första delen av protokollet (avsnitt 1) visade hur man undersöker specificiteten eller gemensamheten hos N-glykaner fästa på Asn-69 av det humana prostataspecifika antigenet (PSA) med hjälp av GlyConnect-plattformen. Vävnadsberoende (urin och sädesvätska), liksom isoformberoende (normala och höga pI) variationer i glykanuttryck, betonades med hjälp av två visualiseringsverktyg (figur 4 och figur 5). Fö…

Discussion

GlyConnect Octopus som ett verktyg för att avslöja oväntade korrelationer
GlyConnect Octopus var ursprungligen utformad för att fråga databasen med en lös definition av glykaner. Faktum är att litteraturen ofta rapporterar de viktigaste egenskaperna hos glykaner i ett glykom, såsom att fukosyleras eller sialyleras, vara gjorda av två eller flera antenner etc. Dessutom klassificeras glykaner oavsett om de är N- eller O-länkade i kärnor, som beskrivs i referenshandboken Essentials of <sup cl…

Materials

internet connection	user's choice
recent version of web browser	user's choice