Mikrotubuli, som er tubulinpolymerer, spiller en avgjørende rolle som cytoskjelettkomponent i eukaryote celler og er kjent for sin dynamiske ustabilitet. Denne studien utviklet en metode for fraksjonering av mikrotubuli for å skille dem i stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og fritt tubulin for å evaluere stabiliteten til mikrotubuli i forskjellige musevev.
Mikrotubuli, sammensatt av α/β-tubulindimerer, er en avgjørende komponent i cytoskjelettet i eukaryote celler. Disse rørlignende polymerene utviser dynamisk ustabilitet da tubulinheterodimerunderenheter gjennomgår repeterende polymerisering og depolymerisering. Nøyaktig kontroll av mikrotubuli stabilitet og dynamikk, oppnådd gjennom tubulin posttranslasjonelle modifikasjoner og mikrotubuli-assosierte proteiner, er avgjørende for ulike cellulære funksjoner. Dysfunksjoner i mikrotubuli er sterkt involvert i patogenesen, inkludert nevrodegenerative lidelser. Pågående forskning fokuserer på mikrotubuli-målrettede terapeutiske midler som modulerer stabilitet, og tilbyr potensielle behandlingsalternativer for disse sykdommene og kreftene. Følgelig er forståelse av den dynamiske tilstanden til mikrotubuli avgjørende for å vurdere sykdomsprogresjon og terapeutiske effekter.
Tradisjonelt har mikrotubulidynamikk blitt vurdert in vitro eller i dyrkede celler gjennom grov fraksjonering eller immunoassay, ved bruk av antistoffer rettet mot posttranslasjonelle modifikasjoner av tubulin. Det er imidlertid utfordringer å analysere tubulinstatus i vev nøyaktig ved hjelp av slike prosedyrer. I denne studien utviklet vi en enkel og innovativ fraksjoneringsmetode for mikrotubuli for å skille stabile mikrotubuli, labile mikrotubuli og fritt tubulin i musevev.
Prosedyren involverte homogenisering av dissekerte musevev i en mikrotubuli-stabiliserende buffer ved et volumforhold på 19: 1. Homogenatene ble deretter fraksjonert gjennom en to-trinns ultrasentrifugeringsprosess etter innledende langsom sentrifugering (2,400 × g) for å fjerne rusk. Det første ultrasentrifugeringstrinnet (100 000 × g) utfelte stabile mikrotubuli, mens den resulterende supernatanten ble utsatt for et andre ultrasentrifugeringstrinn (500 000 × g) for å fraksjonere labile mikrotubuli og oppløselige tubulindimerer. Denne metoden bestemte proporsjonene av tubulin som utgjør stabile eller labile mikrotubuli i musehjernen. I tillegg ble det observert forskjellige vevsvariasjoner i mikrotubulistabilitet som korrelerte med den proliferative kapasiteten til bestanddeler. Disse funnene fremhever det betydelige potensialet i denne nye metoden for å analysere mikrotubuli stabilitet i fysiologiske og patologiske forhold.
Mikrotubuli (MT) er langstrakte rørformede strukturer som består av protofilamenter bestående av α/β-tubulin heterodimer underenheter. De spiller viktige roller i ulike cellulære prosesser som celledeling, motilitet, formvedlikehold og intracellulær transport, noe som gjør dem til integrerte komponenter i det eukaryote cytoskelettet1. Minus-enden av MT, hvor α-tubulin-subenheten er eksponert, er relativt stabil, mens plussenden, hvor β-tubulin-underenheten eksponeres, gjennomgår dynamisk depolymerisering og polymerisering2. Denne kontinuerlige syklusen av tubulindimeraddisjon og dissosiasjon i plussenden, referert til som dynamisk ustabilitet, resulterer i en repeterende prosess med redning og katastrofe3. MTs viser fokusdomener med lokaliserte variasjoner i dynamisk ustabilitet, inkludert stabile og labile domener4.
Nøyaktig kontroll av MTs dynamiske ustabilitet er avgjørende for mange cellulære funksjoner, spesielt i nevroner preget av intrikate morfologier. Tilpasningsevnen og holdbarheten til MTs spiller en viktig rolle i utviklingen og riktig funksjon av nerveceller 5,6,7. Den dynamiske ustabiliteten til MT har vist seg å være forbundet med forskjellige posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) av tubulin, slik som acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinering, delta 2, polyglutaminoksidasjon og polyglyylering. I tillegg fungerer bindingen av mikrotubuli-assosierte proteiner (MAPs) som en reguleringsmekanisme8. PTM, unntatt acetylering, forekommer hovedsakelig i det tubulinkarboksyterminale området som ligger på den ytre overflaten av MT. Disse modifikasjonene skaper forskjellige overflateforhold på MT-er, påvirker deres interaksjon med MAP-er og styrer til slutt MT-stabilitet9. Tilstedeværelsen av en karboksy-terminal tyrosinrest i α-tubulin indikerer dynamiske MT-er, som raskt erstattes av det frie tubulinbassenget. Omvendt betyr detyrosinering av karboksyterminalen og acetylering av Lys40 stabile MT-er med redusert dynamisk ustabilitet 9,10.
PTM av tubulin har blitt mye brukt i eksperimenter for å vurdere dynamikken og stabiliteten til MTs 5,7,11,12,13,14,15. For eksempel, i cellekulturstudier, kan tubuliner deles inn i to bassenger: det frie tubulinbassenget og MT-bassenget. Dette oppnås ved å frigjøre fritt tubulin gjennom cellepermeabilisering før fiksering av de resterende MTene 15,16,17,18,19. Biokjemiske metoder innebærer bruk av kjemiske MT-stabilisatorer som beskytter MT mot katastrofe, noe som muliggjør separasjon av MT og fritt tubulin gjennom sentrifugering20,21,22. Imidlertid skiller disse prosedyrene ikke mellom stabile og mindre stabile (labile) MTs, og gjør det dermed umulig å kvantifisere MTs eller løselig tubulin i vev som hjernen. Følgelig har evaluering av MT-stabilitet i organismer under fysiologiske og patologiske forhold vist seg å være utfordrende. For å løse denne eksperimentelle begrensningen har vi utviklet en ny teknikk for nøyaktig separering av MT og fritt tubulin i musevev23.
Denne unike MT-fraksjoneringsmetoden involverer vevshomogenisering under forhold som opprettholder tubulinstatus i vev og to-trinns sentrifugering for å skille stabile MT-er, labile MT-er og fritt tubulin. Denne enkle prosedyren kan brukes på brede studier, inkludert grunnleggende forskning på MTs og MAPs i levende organismer, fysiologiske og patologiske analyser av helse og sykdommer forbundet med MT-stabilitet, og utvikling av medisiner og andre terapeutiske midler som retter seg mot MT.
Den viktigste oppgaven når man undersøker statusen til tubulin i vev fra levende organismer, forhindrer utilsiktet MT-polymerisering eller depolymerisering under fremstilling. Stabiliteten til MT i prøver påvirkes av faktorer som konsentrasjonen av Taxol i MSB, andelen vevsmengde til buffer og temperatur under prosessen fra fjerning av vev til homogenisering og sentrifugering. Derfor ble betingelsene optimalisert i hvert trinn i protokollen for å analysere musevev med et 20 ganger volum homogenat. En høyere konsent…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis av JST etableringen av universitetsstipendier mot etableringen av vitenskapelig teknologisk innovasjon (A.HT .; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), et stipend-i-hjelp for vitenskapelig forskning (B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), et stipend-i-hjelp for vitenskapelig forskning på innovative områder med tittelen “Brain Protein Aging and Dementia Control” fra MEXT (TM; 26117004), og av Uehara Research Fellowship fra Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
AKTA prime plus | Cytiva | ||
anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |