Registrazione della corrente di giunzione gap dagli ovociti xenopus

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per esprimere le proteine gap junction negli ovociti Xenopus e registrare la corrente giunzionale tra due ovociti apposti utilizzando un amplificatore commerciale progettato per registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti in una modalità di misurazione della corrente laterale elevata.

Abstract

L'espressione eterologa di connessioni e innexine negli ovociti di Xenopus è un approccio potente per studiare le proprietà biofisiche delle giunzioni gap (GJ). Tuttavia, questo approccio è tecnicamente impegnativo perché richiede un morsetto di tensione differenziale di due ovociti opposti che condividono un terreno comune. Sebbene un piccolo numero di laboratori sia riuscito a eseguire questa tecnica, essenzialmente tutti hanno utilizzato amplificatori fatti in casa o amplificatori commerciali progettati per registrazioni di singoli ovociti. Spesso è difficile per altri laboratori implementare questa tecnica. Sebbene una modalità di misurazione della corrente laterale elevata sia stata incorporata in un amplificatore commerciale per le registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti, non c'era stata alcuna segnalazione per la sua applicazione fino al nostro recente studio. Abbiamo reso l'approccio di misurazione della corrente laterale elevata più pratico e conveniente introducendo diverse modifiche tecniche, tra cui la costruzione di una piattaforma di registrazione a base magnetica che consente il posizionamento preciso di ovociti e vari elettrodi, l'uso della soluzione del bagno come conduttore negli elettrodi differenziali di tensione, l'adozione di un elettrodo KCl commerciale a bassa perdita come elettrodo di riferimento, fabbricazione di elettrodi di corrente e tensione da capillari di vetro a parete sottile e posizionamento di tutti gli elettrodi utilizzando dispositivi a base magnetica. Il metodo qui descritto consente registrazioni convenienti e robuste della corrente giunzionale (I_j) tra due ovociti Xenopus opposti.

Introduzione

I GJ sono canali intercellulari che possono consentire il flusso di corrente e lo scambio di piccole molecole citosoliche tra cellule vicine. Esistono in molti tipi di cellule e svolgono diverse funzioni fisiologiche. I GJ nei vertebrati sono formati da connessioni, mentre quelli negli invertebrati da innexine. Ogni GJ è costituito da due emicanali giustapposti con 6 o 8 subunità per emicanale, a seconda che siano connesse o innexine ^1,2,3. Gli esseri umani hanno 21 geni della connexina⁴, mentre i modelli di invertebrati comunemente usati C. elegan....

Protocollo

Gli interventi chirurgici vengono eseguiti seguendo un protocollo approvato dal comitato istituzionale per la cura degli animali della University of Connecticut School of Medicine.

1. Chirurgia della rana e preparazione di ovociti defollicuti

1. Anestetizzare una femmina adulta di rana artigliata africana (Xenopus laevis) (Tabella dei materiali) immergendola in una soluzione fredda (con ghiaccio) di tricaina (~ 300 mg / L).
2. Attendere (~ 15 minuti) fino a quando la rana mostra poca o nessuna risposta alla spremitura dei piedi palmati. Adagiare la rana su un tavolo operatorio con la ....

Risultati

UNC-7 e UNC-9 sono innexins di C. elegans. Mentre UNC-9 ha una sola isoforma, UNC-7 ha più isoforme che differiscono principalmente per la lunghezza e la sequenza amminoacidica dei loro terminali amminici ^7,8. Queste annessine possono formare GJ omotipici ed eterotipici (di UNC-7 e UNC-9) quando espressi negli ovociti di Xenopus ^7,8. Le tracce rappresentative I_j e le .......

Discussione

L'ottimizzazione del sistema sembra essere necessaria per gli esperimenti a doppio morsetto di tensione degli ovociti. Senza di esso, le registrazioni possono essere altamente instabili e gli amplificatori potrebbero dover iniettare una quantità eccessiva di corrente per raggiungere il Vm target, con conseguente danno agli ovociti e guasti di registrazione. Diversi fattori sono fondamentali per ottenere registrazioni stabili di doppi ovociti con il metodo di misurazione della corrente laterale elevata. Innanzitu.......

Materiali

Supporto Capillari in vetro Drummond Base portante magnetica Strumento smussatore per microelettrodi Supporto per microelettrodi

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
magnetico per ponte agar	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	Più stabile del morsetto per tubi Narishige grazie alla sua base magnetica più grande, ma richiede modifiche per accogliere una presa femmina da 2 mm.
Iniettore automatico di nanolitri	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	Iniettore automatizzato di nanolitri	Nanoject II
Collagenase, tipo II	Gibco-USA, Langley, OK, USA	17101-015
Diamond Scriber	Microscopia elettronica Sciences, Hatfield, PA, USA	62108-ST
Sonda di tensione differenziale	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	7255DI
Convertitore di segnale analogico-digitale	Molecular Devices, San Jose, CA, USA	Pinzette Digidata 1440A
Dumont #5	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500341
	Scientific Company, Broomall, PA, USA	3-000-203-G/X
Taglierina a filo caldo	Amazon.com	Proxxon 37080	Un'alternativa è Hercules 8500 DHWT, che ha un pedale di comando a pedale.
Ialuronidasi, tipo I-S	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	H3506
	Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, USA	MB-L-45
	, Novato, CA, USA	BV-10
	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	MEH1S15
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument, , Novato, CA, USA	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA	438733	Microwell Minitray
Nylon mesh	Component Supply Company, Sparta, TN, USA	U-CMN-1000
Amplificatore a morsetto per ovociti	Warner Strumenti, , Hamden, CT, USA	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2020b
pClamp	Molecular Devices, , San Jose, CA, USA	Versione 10
Elettrodo di riferimento	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	DRIREF-2SH	Specifiche: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (inibitore della ribonucleasi)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
Sutura di seta 5-0	Covidien, North Haven, CT, USA	VS890
Spettrofotometro NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	TW150F-4
Morsetto	per tubiNarishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	Pronto all'uso ma la sua posizione è soggetta a spostamento a causa della piccola base magnetica.
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, Florida, Stati Uniti d'America	IMP-XL-FM