توليد وتوسيع خطوط ورم المتوسطة الجنبي الأولي الخبيث
Summary
الهدف من ورقة هذه الطريقة هو إظهار منهجية قوية وقابلة للتكرار لإثراء وتوليد وتوسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية من ورم المتوسطة الجنبي المستأصل جراحيا.
Abstract
المنهجيات الحالية لتوسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية من أنواع الأورام النادرة غير موجودة. يصف هذا البروتوكول طرق توسيع الخلايا السرطانية الأولية من ورم المتوسطة الجنبي الخبيث المقطوع جراحيا (MPM) من خلال تقديم نظرة عامة كاملة على العملية من الهضم إلى التخصيب والتوسع والحفظ بالتبريد والتوصيف الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم هذا البروتوكول مفاهيم لتوليد الورم قد تكون مفيدة لأنواع متعددة من الأورام مثل التربسينات التفاضلية وتأثير طرق التفكك على اكتشاف علامات سطح الخلية للتوصيف المظهري. القيد الرئيسي لهذه الدراسة هو اختيار الخلايا السرطانية التي ستتوسع في نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D). يمكن أن تؤدي الاختلافات في هذا البروتوكول ، بما في ذلك أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ومكملات الوسائط ، وطلاء الألواح لتحسين الالتصاق ، وطرق التصنيف البديلة ، إلى تحسين هذه التقنية ومعدل النجاح الإجمالي لإنشاء خط ورم. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة أساسية لإنشاء وتوصيف الخلايا السرطانية من هذا الورم النادر.
Introduction
ورم المتوسطة الجنبي الخبيث (MPM) هو ورم نادر يرتبط ارتباطا وثيقا بالتعرض للأسبستوس. على الرغم من أن النهج القائمة على العلاج المناعي قد أظهرت نتائج مشجعة ، إلا أن هناك ندرة في خيارات العلاج المتاحة للمرضى الذين يصابون بهذا المرض ، ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات منخفض 1,2. وتبذل حاليا جهود في مؤسسات متعددة لفهم هذا المرض بشكل أفضل وتحديد أهداف علاجية جديدة قد تحسن نتائج المرضى. في حين أن هناك العديد من نماذج الفئران ورم المتوسطة ، فإن الوصول إلى خلايا ورم المتوسطة الأولية أكثر محدودية3. في المختبر ، سيوفر التوسع في خلايا ورم المتوسطة الأولية نظاما نموذجيا قيما يمكن استخدامه لدراسة الخلايا السرطانية مباشرة وتفاعلها مع الخلايا المناعية الذاتية مثل الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم. في حين كانت هناك تقارير عن توسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية لورم المتوسطة ، إلا أنها قليلة ولا توفر إجراء تشغيليا قياسيا مفصلا (SOP). علاوة على ذلك ، تتوفر خطوط خلوية قليلة من مصادر تجارية مثل مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC). في حين أن توافر خطوط الورم الأولية محدود ، فقد ثبت أنه يمكن توسيع الخلايا السرطانية من الانصباب الجنبي ومباشرة من أنسجة الورم 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن خطوط الخلايا السرطانية الموسعة تحافظ على المظهر الجزيئي للورم الأصلي 4,5,6.
يدرس مختبرنا البيئة الدقيقة المناعية للورم في MPM وقد طور طريقة لتوسيع خطوط الخلايا السرطانية MPM الأولية من الحالات التي تم استئصالها جراحيا. هذه الطريقة مقتبسة من تجربتنا في إنشاء خطوط الخلايا السرطانية الميلانينية النقيلية الأولية. الهدف من هذا العمل هو توفير نهج مفصل وعملي لتوسيع خط ورم المتوسطة الأولي باستخدام نظام نموذج 2D والتنميط الظاهري اللاحق. وبالنظر إلى النجاح الأخير لاستراتيجيات حصار نقاط التفتيش التي تستهدف CTLA4 و PD-1 في إعداد الخط الأول2 ، فإن القدرة على توليد العديد من خطوط الورم الأولية يمكن أن تعزز فهم كل من آليات المقاومة الجوهرية للورم بالإضافة إلى توفير نظام نموذجي مهم لتقييم التعرف على الخلايا التائية ، وبالتالي تعميق فهمنا للاستجابة المناعية في MPM.
القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو أن كل ورم يحتوي على بيئة دقيقة مختلفة ، وهناك درجة عالية من التباين في نجاح التوسع. بالإضافة إلى ذلك ، تختار هذه الطريقة الخلايا السرطانية التي يمكن أن تتوسع في نظام زراعة 2D. يمكن أن توفر الطرق الأخرى التي تنطوي على إنتاج كروية 3D أو ثقافة عضوية نهجا بديلا قد يسمح بمعدل نجاح أعلى للتوسع أو يؤدي إلى القدرة على اشتقاق خطوط الخلايا غير القادرة على التوسع في نظام 2D التقليدي. وقد ثبت أن هذه الثقافات 3D لتكون مفيدة لتوليد أنواع الأورام التي يصعب توسيعها ، على سبيل المثال ، سرطان البنكرياس7.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن هذا البروتوكول واضح ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها عن كثب. يعد تجميد المرور المبكر مهما للحفاظ على القدرة على تكرار عملية إثراء الخلايا السرطانية إذا لم تنجح في البداية. تعد القدرة على تقييم تلوث الخلايا الليفية بالعين لتحديد تقنية الانقسام الصحيح وتجويع الوس…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشيد براكيل لازا بريفيسكا لمساهمتها في بدء هذا البروتوكول والدكتور بوريس سيبيسي ورضا مهران وديفيد رايس للتعاون في مجموعات الأنسجة. ولا يوجد تمويل إضافي مرتبط بهذا العمل.
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
Riferimenti
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101 (2020).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
