Generación y expansión de líneas tumorales de mesotelioma pleural maligno primario

Summary

El objetivo de este documento de método es demostrar una metodología robusta y reproducible para el enriquecimiento, generación y expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de mesotelioma pleural resecado quirúrgicamente.

Abstract

Faltan metodologías actuales para la expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de tipos de tumores raros. Este protocolo describe métodos para expandir las células tumorales primarias del mesotelioma pleural maligno (MPM) resecado quirúrgicamente al proporcionar una visión general completa del proceso desde la digestión hasta el enriquecimiento, la expansión, la criopreservación y la caracterización fenotípica. Además, este protocolo introduce conceptos para la generación de tumores que pueden ser útiles para múltiples tipos de tumores, como la tripsinización diferencial y el impacto de los métodos de disociación en la detección de marcadores de superficie celular para la caracterización fenotípica. La principal limitación de este estudio es la selección de células tumorales que se expandirán en un sistema de cultivo bidimensional (2D). Las variaciones de este protocolo, incluidos los sistemas de cultivo tridimensionales (3D), los suplementos de medios, el recubrimiento de placas para mejorar la adhesión y los métodos alternativos de desagregación, podrían mejorar esta técnica y la tasa de éxito general de establecer una línea tumoral. En general, este protocolo proporciona un método básico para establecer y caracterizar las células tumorales de este tumor raro.

Introduction

El mesotelioma pleural maligno (MPM) es un tumor poco frecuente altamente asociado con la exposición al asbesto. Aunque los enfoques basados en la inmunoterapia han mostrado resultados alentadores, hay una escasez de opciones de tratamiento disponibles para los pacientes que desarrollan esta enfermedad, y la tasa general de supervivencia a 5 años es baja ^1,2. Se están realizando esfuerzos en múltiples instituciones para comprender mejor esta enfermedad e identificar nuevos objetivos terapéuticos que puedan mejorar los resultados de los pacientes. Si bien existen múltiples modelos de ratón con mesotelioma, el acceso a las células tumorales primarias del mesotelioma es más limitado³. La expansión in vitro de las células tumorales del mesotelioma primario proporcionaría un valioso sistema modelo que se puede utilizar para estudiar las células tumorales directamente y su interacción con las células inmunes autólogas, como los linfocitos infiltrantes de tumores. Si bien ha habido informes sobre la expansión de las líneas de células tumorales de mesotelioma primario, estas son pocas y no proporcionan un procedimiento de operación estándar (SOP) detallado. Además, pocas líneas celulares están disponibles en fuentes comerciales como American Type Culture Collection (ATCC). Si bien la disponibilidad de líneas tumorales primarias es limitada, se ha demostrado que las células tumorales pueden expandirse a partir de derrames pleurales y directamente desde el tejido tumoral ^4,5. Además, se ha demostrado que las líneas celulares tumorales expandidas preservan el perfil molecular del tumor original ^4,5,6.

Nuestro laboratorio está estudiando el microambiente inmune al tumor de MPM y ha desarrollado un método para expandir las líneas de células tumorales primarias de MPM a partir de casos resecados quirúrgicamente. Este método se adapta de nuestra experiencia en el establecimiento de líneas celulares tumorales de melanoma metastásico primario. El objetivo de este trabajo es proporcionar un enfoque detallado y práctico para la expansión de la línea tumoral de mesotelioma primario utilizando un sistema modelo 2D y el posterior perfil fenotípico. Dado el éxito reciente de las estrategias de bloqueo de puntos de control dirigidas a CTLA4 y PD-1 en el entorno de primera línea², la capacidad de generar muchas líneas tumorales primarias podría promover la comprensión de ambos mecanismos intrínsecos de resistencia tumoral, así como proporcionar un sistema modelo importante para evaluar el reconocimiento de células T, profundizando así nuestra comprensión de la respuesta inmune en MPM.

La principal limitación de este protocolo es que cada tumor contiene un microambiente diferente, y hay un alto grado de variabilidad del éxito de la expansión. Además, este método selecciona células tumorales que pueden expandirse en un sistema de cultivo 2D. Otros métodos que implican la producción de un esferoide 3D o un cultivo de organoides podrían proporcionar un enfoque alternativo que puede permitir una mayor tasa de éxito de expansión o dar como resultado la capacidad de derivar líneas celulares que no pueden expandirse en un sistema 2D tradicional. Se ha demostrado que estos cultivos 3D son útiles para la generación de tipos de tumores que son difíciles de expandir, por ejemplo, el cáncer de páncreas⁷.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Junta de Revisión de Instituciones (IRB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Esto se refiere a los tumores MPM resecados quirúrgicamente de atención estándar que se extirpan después del consentimiento informado. 1. Preparación de medios de digestión tumoral y otros medios asociados Para preparar los medios de digestión tumoral, agregue 5 ml de pen/estreptococo al 100% (penicili…

Representative Results

Para determinar la contaminación por fibroblastos de cultivos de paso temprano, las células se evalúan utilizando un microscopio de fase invertida para identificar la frecuencia de fibroblastos en relación con las otras células adherentes presentes. La Figura 1 muestra ejemplos de aumento de la contaminación por fibroblastos del 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) y 30% (Figura 1C), en comparación c…

Discussion

Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben seguirse de cerca. La congelación temprana del paso es importante para preservar la capacidad de repetir el proceso de enriquecimiento de células tumorales si inicialmente no tiene éxito. La capacidad de evaluar la contaminación fibroblástica a ojo para decidir la correcta técnica de división e inanición media es vital para prevenir el crecimiento excesivo de fibroblastos en el cultivo. Además, el método de tripsinización diferencial req…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML