قياس معدل استهلاك الأكسجين في شرائح السترياتال الحادة من الفئران البالغة
Summary
معدل استهلاك الأكسجين (OCR) هو وكيل شائع لوظيفة الميتوكوندريا ويمكن استخدامه لدراسة نماذج الأمراض المختلفة. لقد طورنا طريقة جديدة باستخدام محلل Seahorse XF لقياس OCR مباشرة في شرائح مخططة حادة من الفئران البالغة التي هي أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية من الطرق الأخرى.
Abstract
تلعب الميتوكوندريا دورا مهما في إنتاج ATP الخلوي ، وتنظيم أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتحكمفي تركيز Ca 2 +. وقد تورط خلل الميتوكوندريا في التسبب في العديد من الأمراض العصبية التنكسية، بما في ذلك مرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون، ومرض الزهايمر. لدراسة دور الميتوكوندريا في نماذج هذه الأمراض ، يمكننا قياس تنفس الميتوكوندريا عن طريق معدل استهلاك الأكسجين (OCR) كوكيل لوظيفة الميتوكوندريا. وقد تم بالفعل قياس OCR بنجاح في مزارع الخلايا ، وكذلك الميتوكوندريا المعزولة. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات أقل أهمية من الناحية الفسيولوجية من قياس OCR في شرائح الدماغ الحادة. للتغلب على هذا القيد ، طور المؤلفون طريقة جديدة باستخدام محلل Seahorse XF لقياس OCR مباشرة في شرائح المخططين الحادة من الفئران البالغة. تم تحسين هذه التقنية مع التركيز على المخطط ، وهي منطقة في الدماغ تشارك في مرض باركنسون ومرض هنتنغتون. يقوم المحلل بإجراء فحص للخلايا الحية باستخدام لوحة من 24 بئرا ، مما يسمح بالقياس الحركي المتزامن ل 24 عينة. تستخدم هذه الطريقة قطعا دائرية مثقوبة من شرائح الدماغ المخططة كعينات. نحن نثبت فعالية هذه التقنية من خلال تحديد OCR القاعدي السفلي في شرائح مخططة لنموذج الماوس من PD. ستكون هذه الطريقة ذات أهمية واسعة للباحثين العاملين في مجال PD ومرض هنتنغتون.
Introduction
تورط خلل الميتوكوندريا في العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، ومرض هنتنغتون ، ومرض الزهايمر1،2،3. تعرض نماذج PD مثل الفئران والجرذان بالضربة القاضية PINK1 (KO) ضعف وظيفة الميتوكوندريا4،5،6،7،8،9،10،11. الميتوكوندريا المعزولة من المخطط (STR) أو الدماغ الكامل لفأر PINK1 KO القديم تظهر عيوبا في المجمع I 7,10,12,13. يعد القياس المباشر لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) أحد أكثر الطرق شيوعا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا نظرا لأن OCR يقترن بإنتاج ATP ، وهي الوظيفة الرئيسية للميتوكوندريا14. لذلك ، يمكن أن يساعد قياس OCR في نماذج الأمراض أو العينات / الأنسجة المشتقة من المريض في التحقيق في كيفية تسبب خلل الميتوكوندريا في المرض.
حاليا ، هناك عدة طرق لقياس التعرف الضوئي على الحروف الميتوكوندريا ، بما في ذلك قطب كلارك والأقطاب الكهربائية الأخرى O 2 ، وصبغة الفلورسنت O2 ، ومحلل التدفق خارج الخلية15،16،17،18،19. كميزة ، تسمح الطرق القائمة على القطب الكهربائي O2 بإضافة ركائز مختلفة بسهولة. ومع ذلك ، فهي غير كافية لقياس عدة عينات في وقت واحد. بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على القطب الكهربائي O2 ، فإن محلل التدفق خارج الخلية ، وهو أداة شائعة الاستخدام للتعرف الضوئي على الحروف في مزارع الخلايا أو الميتوكوندريا النقية ، يوفر إنتاجية محسنة15،18،20. ومع ذلك ، عادة ما يتم تطبيق كل هذه الطرق لقياس OCR في الميتوكوندريا المعزولة أو مزارع الخلايا6،16،17،19،20،21. تسبب عزلة الميتوكوندريا أضرارا غير مقصودة ، والميتوكوندريا المستخرجة أو مزارع الخلايا أقل أهمية من الناحية الفسيولوجية من شرائح الدماغ السليمة22. حتى عندما يتم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة في شرائح ، فهي أقل حساسية وأكثر صعوبة في العمل من الخلايا المستزرعة23.
ولمواجهة هذه التحديات، طورنا طريقة باستخدام محلل التدفق خارج الخلية XF24، والذي يسمح بتحليل معلمات التمثيل الغذائي المتعددة من شرائح الدماغ المخططة الحادة للفئران24. توفر هذه التقنية تحديد كمي مباشر مستمر لتنفس الميتوكوندريا عبر OCR. باختصار ، يتم وضع أجزاء صغيرة من شرائح الدماغ المخططة في آبار صفيحة الجزيرة ، ويستخدم المحلل أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الأكسجين والبروتون الفلورسنت لقياس معدل التعرف الضوئي على الحروف والتحمض خارج الخلية ، على التوالي17،21،25.
واحدة من السمات الفريدة للمحلل هي آبار الحقن الأربعة ، والتي تسمح باستمرار قياس OCR مع حقن ما يصل إلى أربعة مركبات أو كواشف بالتتابع. وهذا يتيح قياس العديد من معلمات التنفس الخلوي ، مثل التعرف الضوئي على الحروف للميتوكوندريا القاعدية ، والتعرف الضوئي على الحروف المرتبط ب ATP ، والتعرف الضوئي على الحروف للميتوكوندريا القصوى. كانت المركبات التي تم حقنها أثناء قياسات البروتوكول الموضح هنا تركيزات عمل تبلغ 10 ميكرومتر بيروفات في بئر المحلول الأول (المنفذ A) ، و 20 ميكرومتر أوليغومايسين في بئر المحلول الثاني (المنفذ B) ، و 10 ميكرومتر من سيانيد الكربونيل 4-(trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP) في البئر الثالث (المنفذ C) ، و 20 ميكرومتر مضاد للمايسين A في البئر الرابع (الميناء D) ، استنادا إلى Fried et al.25. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التركيزات كانت تركيزات عاملة، وتم حقن محاليل المخزون من 10x و 11x و 12x و 13x في منافذ المحلول من A إلى D على التوالي. وكان الغرض من استخدام كل حل على النحو التالي: 1) كان البيروفات ضروريا لأنه بدونه سيكون لإضافة FCCP استجابة OCR منخفضة ناجمة عن الحد من الركائز المتاحة. 2) Oligomycin يمنع ATP synthase ويسمح بقياس التنفس المرتبط ب ATP ؛ 3) FCCP يفصل الأكسدة من الفسفرة ويسمح بقياس قدرة الميتوكوندريا القصوى ؛ 4) يمنع Antimycin A المركب III في سلسلة نقل الإلكترون ، وبالتالي يسمح بقياس OCR غير المرتبط بالميتوكوندريا.
تم تحديد تركيز الأوليغوميسين المستخدم بناء على الأسباب التالية: 1) الجرعة الموصى بها من الأوليغوميسين لمعظم أنواع الخلايا (الميتوكوندريا المعزولة أو مزارع الخلايا) هي 1.5 ميكرومتر. من التجربة ، عادة ما يتم استخدام 3x-10x من جرعة الخلايا المنفصلة لتجارب الشرائح نظرا لأنه قد يكون هناك تدرج ، ويستغرق تغلغل المحلول في الشرائح وقتا. لذلك ، يجب أن يكون التركيز في حدود 5 ميكرومتر إلى 25 ميكرومتر. 2) تم اختيار تركيز 20 ميكرومتر بناء على Fried et al.25. لم يتم تجربة تركيزات أعلى بسبب السمية غير المحددة للأوليغومايسين. 3) في تقرير أندروود وآخرون 26 ، أجرى المؤلفون تجربة معايرة للأوليغوميسين ووجدوا أن الجرعات عند 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكروغرام / مل أدت إلى تثبيط مماثل. التركيز العالي للأوليغومايسين (50 ميكروغرام / مل) لم يمنع أكثر ولكن كان له تباين أكبر. 4) في ملاحظتنا ، يبدو أن العامل الحاسم هو القدرة على اختراق الأوليغومايسين. من الصعب على oligomycin اختراق الأنسجة ، وهذا هو السبب في أن الأمر يستغرق ما لا يقل عن 7 إلى 8 دورات للوصول إلى الهضبة ، وهي الاستجابة القصوى. طالما أنه يصل إلى الهضبة ، يفترض أن يكون التثبيط هو الحد الأقصى.
يتمثل أحد التحديات التقنية الرئيسية لتكييف محلل التدفق خارج الخلية لقياس OCR في الشرائح المخططة في منع نقص الأكسجة في الأنسجة. نظرا لأن المخزن المؤقت لم يكن مؤكسجا طوال مدة القياسات (حوالي 4 ساعات) ، كان نقص الأكسجة مشكلة مركزية. وينطبق هذا بشكل خاص على عينات الأنسجة الأكثر سمكا، حيث لا يمكن للأكسجين أن ينتشر في جميع أنحاء العينات. للتغلب على هذه المشكلة ، تم تقسيم الشرائح بسماكة 150 ميكرومتر ، بحيث يمكن للأكسجين المحيط اختراق منتصف شرائح الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 4 ملغ / مل من ألبومين المصل البقري (BSA) إلى المخزن المؤقت للسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي قبل الأكسجين (ACSF) ، مما سهل تحديد الحد الأقصى من OCR ، كما اقترح سابقا23. فحصنا ما إذا كانت الخلايا على قيد الحياة. أولا ، تم استخدام Hoechst 33258 (10 ميكرومتر) ويوديد البروبيديوم (10 ميكرومتر) لفحص ما إذا كانت الخلايا صحية في ظل هذه الظروف. ثم فحصنا ما إذا كانت الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة صحية وظيفيا باستخدام تسجيل المشبك التصحيحي. قمنا بتقييم ما إذا كانت محطات الدوبامين (DA) في الشرائح المخططة صحية وظيفيا من خلال قياس إطلاق DA باستخدام قياس الفولتامتر سريع المسح. أظهرت النتائج أن الشرائح المخططة التي لم تكن مؤكسجة (مجموعة ACSF / BSA) كانت صحية مثل المجموعة الضابطة المؤكسجة24.
ثم اختبرنا مجموعات مختلفة من سمك الشريحة وحجم اللكمة لتحديد ظروف الشريحة المخططة المثلى لفحص التنفس التدفقي. تم استخدام شرائح المخططية الظهرية بسماكات مختلفة (150 ميكرومتر و 200 ميكرومتر) وأحجام الثقب (1.0 مم و 1.5 مم و 2.0 مم في القطر) لتحليل OCR باستخدام المحلل. كانت شرائح Striatal التي كان سمكها 150 ميكرومتر مع حجم لكمة قطرها 1.5 مم تتمتع بأعلى كفاءة اقتران و OCRs ضمن نطاق مثالي للمحلل24.
Protocol
Representative Results
Discussion
سمحت الطريقة التي طورناها باستخدام محلل XF لقياس OCR في شرائح مخططة من الفئران البالغة على مدى فترة زمنية تبلغ 4 ساعات. توفر هذه الطريقة طريقة جديدة لقياس الطاقة الحيوية الخلوية في اللكمات المستأصلة من هياكل الدماغ المحددة تشريحيا. نظرا لأن عينات الأنسجة التي يتم تحليلها صغيرة إلى حد ما ، يم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر وانغتشين تسيرينغ وباميلا والتر على قراءتهما النقدية وتحريرهما لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (NS054773 إلى C.J. L. و NS098393 إلى H.Z.) وقسم علم الأعصاب في جامعة توماس جيفرسون (صناديق بدء التشغيل إلى H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Riferimenti
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
