Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen
Summary
Zuurstofverbruik (OCR) is een veel voorkomende proxy voor mitochondriale functie en kan worden gebruikt om verschillende ziektemodellen te bestuderen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen die fysiologisch relevanter is dan andere methoden.
Abstract
Mitochondriën spelen een belangrijke rol bij cellulaire ATP-productie, regulering van reactieve zuurstofsoorten en Ca2+ concentratiecontrole. Mitochondriale disfunctie is betrokken bij de pathogenese van meerdere neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer. Om de rol van mitochondriën in modellen van deze ziekten te bestuderen, kunnen we mitochondriale ademhaling meten via zuurstofverbruik (OCR) als een proxy voor mitochondriale functie. OCR is al met succes gemeten in celculturen, evenals geïsoleerde mitochondriën. Deze technieken zijn echter minder fysiologisch relevant dan het meten van OCR in acute hersensegmenten. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden de auteurs een nieuwe methode met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen. De techniek is geoptimaliseerd met een focus op het striatum, een hersengebied dat betrokken is bij PD en de ziekte van Huntington. De analysator voert een live celtest uit met behulp van een 24-well plaat, die de gelijktijdige kinetische meting van 24 monsters mogelijk maakt. De methode maakt gebruik van cirkelvormig geponste stukjes striatale hersenplakken als monsters. We tonen de effectiviteit van deze techniek aan door een lagere basale OCR te identificeren in striatale plakjes van een muismodel van PD. Deze methode zal van breed belang zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van PD en de ziekte van Huntington.
Introduction
Mitochondriale disfunctie is betrokken bij verschillende neurologische ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer 1,2,3. PD-modellen zoals PINK1 knockout (KO) muizen en ratten vertonen een verminderde mitochondriale functie 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondriën geïsoleerd uit het striatum (STR) of de hele hersenen van de oude PINK1 KO-muis vertonen defecten in complex I 7,10,12,13. Het direct meten van het zuurstofverbruik (OCR) is een van de meest voorkomende methoden om de mitochondriale functie te evalueren, aangezien OCR is gekoppeld aan ATP-productie, de belangrijkste functie van mitochondriën14. Daarom kan het meten van OCR in ziektemodellen of van patiënten afgeleide monsters / weefsel helpen onderzoeken hoe mitochondriale disfunctie tot ziekte leidt.
Momenteel zijn er verschillende manieren om mitochondriale OCR te meten, waaronder de Clark-elektrode en andere O2-elektroden, O2 fluorescerende kleurstof en de extracellulaire fluxanalysator 15,16,17,18,19. Als voordeel maken O2 elektrode-gebaseerde methoden het mogelijk om verschillende substraten eenvoudig toe te voegen. Ze zijn echter onvoldoende om meerdere monsters tegelijkertijd te meten. Vergeleken met traditionele O 2-elektrode-gebaseerde methoden biedt de extracellulaire fluxanalysator, een veelgebruikt hulpmiddel voor OCR in celculturen of gezuiverde mitochondriën, een verbeterdedoorvoersnelheid van 15,18,20. Niettemin worden al deze methoden meestal toegepast om OCR te meten in geïsoleerde mitochondriën of celculturen 6,16,17,19,20,21. De isolatie van mitochondriën veroorzaakt onbedoelde schade en geëxtraheerde mitochondriën of celculturen zijn minder fysiologisch relevant dan intacte hersenplakken22. Zelfs wanneer micro-elektroden in plakjes worden gebruikt, zijn ze minder gevoelig en moeilijker te bedienen dan in gekweekte cellen23.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een methode ontwikkeld met behulp van de XF24 extracellulaire fluxanalysator, die de analyse mogelijk maakt van meerdere metabole parameters van acute striatale hersenplakken van muizen24. Deze techniek zorgt voor continue directe kwantificering van mitochondriale ademhaling via de OCR. Kortom, kleine delen van striatale hersenplakken worden in putten van de eilandplaat geplaatst en de analysator gebruikt zuurstof- en protonfluorescente biosensoren om de OCR- en extracellulaire verzuringssnelheid te meten, respectievelijk 17,21,25.
Een van de unieke kenmerken van de analysator zijn de vier injectieputten, die de voortdurende meting van OCR mogelijk maken terwijl achtereenvolgens maximaal vier verbindingen of reagentia worden geïnjecteerd; dit maakt het mogelijk om verschillende cellulaire ademhalingsparameters te meten, zoals basale mitochondriale OCR, ATP-gebonden OCR en maximale mitochondriale OCR. De verbindingen die tijdens de metingen voor het hier getoonde protocol werden geïnjecteerd, waren werkconcentraties van 10 mM pyruvaat in de eerste oplossingsput (poort A), 20 μM oligomycine in de tweede oplossingsput (poort B), 10 μM carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazon (FCCP) in de derde put (poort C) en 20 μM antimycine A in de vierde put (poort D), gebaseerd op Fried et al.25. Opgemerkt moet worden dat deze concentraties werkconcentraties waren en dat voorraadoplossingen van respectievelijk 10x, 11x, 12x en 13x in de oplossingspoorten A tot en met D werden geïnjecteerd. Het doel van het gebruik van elke oplossing was als volgt: 1) Pyruvaat was noodzakelijk omdat, zonder dit, de toevoeging van FCCP een verminderde OCR-respons zou hebben veroorzaakt door een beperking van beschikbare substraten; 2) Oligomycine remt ATP-synthase en maakt de meting van ATP-gekoppelde ademhaling mogelijk; 3) FCCP ontkoppelt oxidatie van fosforylering en maakt het mogelijk om de maximale mitochondriale capaciteit te meten; 4) Antimycine A remt complex III in de elektronentransportketen en maakt daarom de meting van OCR mogelijk die niet aan de mitochondriën is gekoppeld.
De gebruikte concentratie oligomycine werd bepaald op basis van de volgende redenen: 1) De aanbevolen dosis oligomycine voor de meeste celtypen (geïsoleerde mitochondriën of celculturen) is 1,5 μM. Uit ervaring blijkt dat meestal 3x-10x van de dosis gedissocieerde cellen wordt gebruikt voor de plakexperimenten, omdat er een gradiënt kan zijn en de penetratie van oplossing in de plakjes tijd kost. Daarom moet de concentratie in het bereik van 5 μM tot 25 μM liggen. 2) Een 20 μM-concentratie werd geselecteerd op basis van Fried et al.25. Hogere concentraties werden niet geprobeerd vanwege de niet-specifieke toxiciteit van oligomycine. 3) In het rapport van Underwood et al.26 deden de auteurs een titratie-experiment voor oligomycine en ontdekten dat doses bij 6,25, 12,5, 25 en 50 μg / ml resulteerden in vergelijkbare remming. De hogere concentratie oligomycine (50 μg/ml) remde niet meer maar had een grotere variantie. 4) In onze waarneming lijkt de bepalende factor het penetrerende vermogen van oligomycine te zijn. Het is moeilijk voor oligomycine om het weefsel binnen te dringen, en daarom duurt het minstens 7 tot 8 cycli om het plateau te bereiken, de maximale respons. Zolang het het plateau bereikt, wordt aangenomen dat de remming maximaal is.
Een belangrijke technische uitdaging bij het aanpassen van de extracellulaire fluxanalysator voor het meten van OCR in striatale plakjes is het voorkomen van weefselhypoxie. Aangezien de buffer gedurende de gehele duur van de metingen (ongeveer 4 uur) niet van zuurstof was voorzien, was hypoxie een centraal probleem. Dit geldt vooral voor dikkere weefselmonsters, waar zuurstof niet door de monsters kan diffunderen. Om dit probleem op te lossen, werden plakjes gesneden op een dikte van 150 μm, zodat omgevingszuurstof het midden van de hersenplakken kon binnendringen. Bovendien werd 4 mg/ml runderserumalbumine (BSA) toegevoegd aan de buffer voorgeoxygeneerde kunstmatige hersenvocht (ACSF), wat de bepaling van maximale OCR vergemakkelijkte, zoals eerder gesuggereerd23. We onderzochten of cellen nog leefden. Eerst werden Hoechst 33258 (10 μM) en propidiumjodide (10 μM) gebruikt om te onderzoeken of cellen gezond waren onder deze omstandigheden. Vervolgens onderzochten we of medium stekelige neuronen functioneel gezond waren met behulp van patch-clamp-opname. We evalueerden verder of dopamine (DA) terminals in de striatale plakjes functioneel gezond waren door DA-afgifte te meten met behulp van snelle voltammetrie. De resultaten toonden aan dat striatale plakjes die niet van zuurstof waren voorzien (ACSF /BSA-groep) net zo gezond waren als de zuurstofrijke controlegroep24.
Vervolgens hebben we verschillende combinaties van plakdikte en ponsgrootte getest om optimale striatale plakcondities voor de fluxademhalingstest te bepalen. Dorsale striatale plakjes met verschillende diktes (150 μm en 200 μm) en ponsgroottes (1,0 mm, 1,5 mm en 2,0 mm in diameter) werden gebruikt voor OCR-analyse met behulp van de analysator. Striatale plakjes van 150 μm dik met een ponsgrootte van 1,5 mm in diameter hadden de hoogste koppelingsefficiëntie en OCR’s binnen een optimaal bereik voor de analyzer24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de door ons ontwikkelde methode kon een XF-analyzer worden gebruikt voor het meten van OCR in striatale plakjes van volwassen muizen over een tijdspanne van 4 uur. Deze methode biedt een nieuwe manier om cellulaire bio-energetica te meten in stoten die zijn weggesneden uit anatomisch gedefinieerde hersenstructuren. Omdat de weefselmonsters die worden geanalyseerd vrij klein zijn, kunnen de metabole parameters van specifieke hersengebieden die betrokken zijn bij een ziekte worden onderzocht. Bovendien bootst het gebru…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Wangchen Tsering en Pamela Walter voor hun kritische lezing en redactie van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 tot C.J. L. en NS098393 tot H.Z.) en de afdeling Neurowetenschappen aan de Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Riferimenti
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
