מדידת קצב צריכת חמצן בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים
Summary
קצב צריכת חמצן (OCR) הוא פרוקסי נפוץ לתפקוד המיטוכונדריה וניתן להשתמש בו כדי לחקור מודלים שונים של מחלות. פיתחנו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים, שהיא רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית משיטות אחרות.
Abstract
המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חשוב בייצור ATP תאי, בוויסות מיני חמצן תגובתי ובקרת ריכוז Ca2+ . תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה מעורב בפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון ומחלת אלצהיימר. כדי לחקור את תפקידה של המיטוכונדריה במודלים של מחלות אלה, אנו יכולים למדוד את הנשימה המיטוכונדרית באמצעות קצב צריכת חמצן (OCR) כמייצג לתפקוד המיטוכונדריה. זיהוי תווים אופטי (OCR) כבר נמדד בהצלחה בתרביות תאים, כמו גם במיטוכונדריה מבודדת. עם זאת, טכניקות אלה רלוונטיות פחות מבחינה פיזיולוגית ממדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות מוח חריפות. כדי להתגבר על מגבלה זו, המחברים פיתחו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים. הטכניקה מותאמת תוך התמקדות בסטריאטום, אזור במוח המעורב בפרקינסון ובמחלת הנטינגטון. המנתח מבצע בדיקת תאים חיים באמצעות לוחית של 24 בארות, המאפשרת מדידה קינטית סימולטנית של 24 דגימות. השיטה משתמשת בפיסות מנוקבות עגולות של פרוסות מוח סטריאליות כדגימות. אנו מדגימים את היעילות של טכניקה זו על ידי זיהוי OCR בסיסי נמוך יותר בפרוסות סטריאליות של מודל עכבר של PD. שיטה זו תעניין חוקרים העוסקים בתחום מחלת הפרקינסון והמחלת הנטינגטון.
Introduction
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה מעורב במספר מחלות נוירולוגיות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון ומחלת אלצהיימר 1,2,3. דגמי PD כגון עכברי נוקאאוט PINK1 (KO) וחולדות מציגים תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי 4,5,6,7,8,9,10,11. מיטוכונדריה מבודדת מהסטריאטום (STR) או המוח השלם של עכבר PINK1 KO הזקן מפגינה פגמים בקומפלקס I 7,10,12,13. מדידה ישירה של קצב צריכת החמצן (OCR) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר להערכת תפקוד המיטוכונדריה מכיוון ש-OCR משולב עם ייצור ATP, הפונקציה העיקרית של המיטוכונדריה14. לכן, מדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) במודלים של מחלות או בדגימות/רקמות שמקורן בחולה יכולה לסייע בחקר האופן שבו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למחלות.
נכון לעכשיו, ישנן מספר דרכים למדוד OCR מיטוכונדריאלי, כולל אלקטרודת קלארק ואלקטרודות O2 אחרות, צבע פלואורסצנטי O2, ומנתח השטף החוץ-תאי 15,16,17,18,19. כיתרון, שיטות מבוססות אלקטרודות O2 מאפשרות להוסיף בקלות מצעים שונים. עם זאת, הם אינם מספיקים למדידה בו זמנית של מספר דגימות. בהשוואה לשיטות מסורתיות המבוססות על אלקטרודות O2, מנתח השטף החוץ-תאי, כלי נפוץ ל-OCR בתרביות תאים או מיטוכונדריה מטוהרת, מציע תפוקה משופרתשל 15,18,20. עם זאת, כל השיטות הללו מיושמות בדרך כלל למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) במיטוכונדריה מבודדת או בתרביות תאים 6,16,17,19,20,21. הבידוד של המיטוכונדריה גורם לנזק לא מכוון, ומיטוכונדריה מופקת או תרביות תאים פחות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית מאשר פרוסות מוח שלמות22. גם כאשר משתמשים במיקרו-אלקטרוניקה בפרוסות, הן פחות רגישות וקשות יותר לתפעול מאשר בתאים בתרבית23.
כדי לעמוד באתגרים אלה, פיתחנו שיטה באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי XF24, המאפשרת ניתוח של פרמטרים מטבוליים מרובים מפרוסות מוח סטריאליות חריפות של עכברים24. טכניקה זו מספקת כימות ישיר רציף של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות OCR. בקצרה, חלקים קטנים של פרוסות מוח סטריאליות מוכנסים לבארות של צלחת האי, והמנתח משתמש בביו-סנסורים מבוססי חמצן ופרוטונים פלואורסצנטיים כדי למדוד את ה-OCR ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, בהתאמה 17,21,25.
אחד המאפיינים הייחודיים של המנתח הוא ארבע בארות ההזרקה, המאפשרות את המשך המדידה של זיהוי תווים אופטי (OCR) תוך הזרקה רציפה של עד ארבע תרכובות או ריאגנטים; זה מאפשר מדידה של מספר פרמטרים של נשימה תאית, כגון OCR מיטוכונדריאלי בסיסי, OCR המקושר ל-ATP ו-OCR מיטוכונדריאלי מקסימלי. התרכובות שהוזרקו במהלך המדידות עבור הפרוטוקול המוצג כאן היו ריכוזי עבודה של 10 mM pyruvate בבאר התמיסה הראשונה (יציאה A), 20 μM אוליגומיצין בבאר התמיסה השנייה (יציאה B), 10 μM קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy) פניל-הידרזון (FCCP) בבאר השלישית (יציאה C), ו-20 μM אנטימיצין A בבאר הרביעית (יציאה D), מבוסס על פריד ואח’ 25. יש לציין כי ריכוזים אלה היו ריכוזי עבודה, ותמיסות מלאי של 10x, 11x, 12x ו- 13x הוזרקו ליציאות התמיסה A עד D, בהתאמה. מטרת השימוש בכל פתרון הייתה כדלקמן: 1) פירובט היה נחוץ שכן, בלעדיו, הוספת FCCP תהיה תגובת OCR מופחתת הנגרמת על ידי הגבלה של מצעים זמינים; 2) אוליגומיצין מעכב ATP סינתאז ומאפשר מדידה של נשימה מקושרת ATP; 3) FCCP משחרר את החמצון מזרחון ומאפשר מדידה של קיבולת מיטוכונדריאלית מקסימלית; 4) אנטימיצין A מעכב קומפלקס III בשרשרת הובלת האלקטרונים, ולכן מאפשר מדידה של OCR שאינו קשור למיטוכונדריה.
ריכוז האוליגומיצין שבו נעשה שימוש נקבע על סמך הסיבות הבאות: 1) המינון המומלץ של אוליגומיצין עבור רוב סוגי התאים (מיטוכונדריה מבודדת או תרביות תאים) הוא 1.5 מיקרומטר. מניסיון, בדרך כלל פי 3-10 ממינון התאים המנותקים משמש לניסויים בפרוסה מכיוון שייתכן שיש שיפוע, והחדירה של התמיסה לפרוסות לוקחת זמן. לכן, הריכוז צריך להיות בטווח של 5 μM עד 25 μM. 2) ריכוז 20 μM נבחר על סמך Fried et al.25. ריכוזים גבוהים יותר לא נוסו בשל הרעילות הלא ספציפית של אוליגומיצין. 3) בדו”ח של Underwood et al.26, החוקרים ערכו ניסוי טיטרציה עבור אוליגומיצין ומצאו כי מינונים של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרוגרם/מ”ל גרמו לעיכוב דומה. הריכוז הגבוה יותר של אוליגומיצין (50 מיקרוגרם/מ”ל) לא עיכב יותר, אך הייתה לו שונות גדולה יותר. 4) בתצפית שלנו, נראה שהגורם הקובע הוא היכולת החודרת של אוליגומיצין. קשה לאוליגומיצין לחדור לרקמה, ולכן לוקח לפחות 7 עד 8 מחזורים להגיע למישור, התגובה המקסימלית. כל עוד הוא מגיע למישור, מניחים שהעיכוב הוא מקסימלי.
אתגר טכני מרכזי בהתאמת מנתח השטף החוץ-תאי למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות סטריאליות הוא למנוע היפוקסיה של רקמות. מכיוון שהמאגר לא היה מחומצן במשך כל משך המדידות (כ-4 שעות), היפוקסיה הייתה בעיה מרכזית. זה נכון במיוחד עבור דגימות רקמה עבות יותר, שבהן חמצן לא יכול להתפזר לאורך הדגימות. כדי להתגבר על בעיה זו, פרוסות נחתכו בעובי של 150 מיקרומטר, כך שחמצן הסביבה יכול היה לחדור לאמצע פרוסות המוח. בנוסף, נוספו 4 מ”ג/מ”ל אלבומין בסרום בקר (BSA) למאגר הנוזלים השדרתיים המלאכותיים (ACSF) שהתחמצן מראש, מה שאיפשר את קביעתו של זיהוי תווים אופטי (OCR) מקסימלי, כפי שהוצע בעבר23. בדקנו אם התאים חיים. ראשית, Hoechst 33258 (10 μM) ו- propidium iodide (10 μM) שימשו כדי לבחון אם התאים היו בריאים בתנאים אלה. לאחר מכן בחנו אם נוירונים קוצניים בינוניים היו בריאים מבחינה תפקודית באמצעות רישום מהדק טלאי. הערכנו עוד אם מסופי דופמין (DA) בפרוסות הסטריאטליות היו בריאים מבחינה תפקודית על ידי מדידת שחרור DA באמצעות וולטמטריה בסריקה מהירה. התוצאות הראו כי פרוסות סטריאליות שלא היו מחומצנות (קבוצת ACSF/BSA) היו בריאות כמו קבוצת הביקורת המחומצנת24.
לאחר מכן בדקנו שילובים שונים של עובי פרוסה וגודל האגרוף כדי לקבוע את תנאי הפרוסה הסטריאלית האופטימליים למבחן הנשימה של השטף. פרוסות סטריאליות דורסליות בעוביים שונים (150 מיקרומטר ו-200 מיקרומטר) וגדלי אגרוף (1.0 מ”מ, 1.5 מ”מ וקוטר 2.0 מ”מ) שימשו לניתוח OCR באמצעות המנתח. פרוסות סטריאטליות בעובי של 150 מיקרומטר עם גודל אגרוף של 1.5 מ”מ קוטר היו בעלות יעילות הצימוד הגבוהה ביותר ו- OCRs בטווח אופטימלי עבור המנתח24.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה שפיתחנו אפשרה למנתח XF לשמש למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות סטריאליות מעכברים בוגרים על פני פרק זמן של 4 שעות. שיטה זו מספקת דרך חדשה למדוד ביו-אנרגיה תאית באגרופים שנלקחו ממבני מוח המוגדרים אנטומית. מאחר שדגימות הרקמה המנותחות קטנות למדי, ניתן לחקור את הפרמטרים המטבוליים של אזור…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לוואנגצ’ן צרינג ולפמלה וולטר על הקריאה הביקורתית והעריכה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) (NS054773 ל- C.J. L. ו- NS098393 ל- H.Z.) והמחלקה למדעי המוח באוניברסיטת תומאס ג’פרסון (קרנות סטארט-אפ ל- H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Riferimenti
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
