Måling av oksygenforbruk i akutte striatale skiver fra voksne mus

Summary

Oksygenforbruk (OCR) er en vanlig proxy for mitokondriell funksjon og kan brukes til å studere ulike sykdomsmodeller. Vi utviklet en ny metode ved hjelp av en Seahorse XF analysator for å direkte måle OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus som er mer fysiologisk relevant enn andre metoder.

Abstract

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellulær ATP-produksjon, reaktiv oksygenartregulering og Ca²⁺ konsentrasjonskontroll. Mitokondriell dysfunksjon har vært involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom og Alzheimers sykdom. For å studere rollen til mitokondrier i modeller av disse sykdommene, kan vi måle mitokondriell respirasjon via oksygenforbruk (OCR) som en proxy for mitokondriell funksjon. OCR har allerede blitt målt i cellekulturer, så vel som isolerte mitokondrier. Disse teknikkene er imidlertid mindre fysiologisk relevante enn å måle OCR i akutte hjerneskiver. For å overvinne denne begrensningen utviklet forfatterne en ny metode ved hjelp av en Seahorse XF-analysator for å måle OCR direkte i akutte striatale skiver fra voksne mus. Teknikken er optimalisert med fokus på striatum, et hjerneområde involvert i PD og Huntingtons sykdom. Analysatoren utfører en levende celleanalyse ved hjelp av en 24-brønns plate, som tillater samtidig kinetisk måling av 24 prøver. Metoden bruker sirkulære stansede biter av striatale hjerneskiver som prøver. Vi demonstrerer effektiviteten av denne teknikken ved å identifisere en lavere basal OCR i striatale skiver av en musemodell av PD. Denne metoden vil være av bred interesse for forskere som arbeider innen PD og Huntingtons sykdom.

Introduction

Mitokondriell dysfunksjon har vært involvert i flere nevrologiske sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom og Alzheimers sykdom ^1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) mus og rotter viser nedsatt mitokondriell funksjon 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isolert fra striatum (STR) eller hele hjernen til alderen PINK1 KO mus viser defekter i kompleks I 7,10,12,13. Direkte måling av oksygenforbrukshastigheten (OCR) er en av de vanligste metodene for å evaluere mitokondriell funksjon siden OCR er kombinert med ATP-produksjon, hovedfunksjonen til mitokondrier¹⁴. Derfor kan måling av OCR i sykdomsmodeller eller pasientavledede prøver / vev bidra til å undersøke hvordan mitokondriell dysfunksjon fører til sykdom.

For tiden er det flere måter å måle mitokondriell OCR på, inkludert Clark-elektroden og andre O 2-elektroder, O₂ fluorescerende fargestoff og den ekstracellulære flussanalysatoren 15,16,17,18,19. Som en fordel tillater O₂ elektrodebaserte metoder at forskjellige underlag enkelt kan tilsettes. De er imidlertid utilstrekkelige til samtidig å måle flere prøver. Sammenlignet med tradisjonelle O₂ elektrodebaserte metoder, tilbyr den ekstracellulære fluksanalysatoren, et vanlig verktøy for OCR i cellekulturer eller rensede mitokondrier, forbedret gjennomstrømning 15,18,20. Likevel brukes alle disse metodene vanligvis til å måle OCR i isolerte mitokondrier eller cellekulturer 6,16,17,19,20,21. Isolering av mitokondrier forårsaker utilsiktet skade, og ekstraherte mitokondrier eller cellekulturer er mindre fysiologisk relevante enn intakte hjerneskiver²². Selv når mikroelektroder brukes i skiver, er de mindre følsomme og vanskeligere å betjene enn i dyrkede celler²³.

For å møte disse utfordringene utviklet vi en metode ved hjelp av XF24 ekstracellulær fluksanalysator, som gjør det mulig å analysere flere metabolske parametere fra akutte striatale hjerneskiver av mus²⁴. Denne teknikken gir kontinuerlig direkte kvantifisering av mitokondriell respirasjon via OCR. Kort fortalt plasseres små deler av striatale hjerneskiver i brønner på øyplaten, og analysatoren bruker oksygen- og protonfluorescerende baserte biosensorer for å måle OCR og ekstracellulær forsuringshastighet, henholdsvis 17,21,25.

En av de unike egenskapene til analysatoren er de fire injeksjonsbrønnene, som tillater fortsatt måling av OCR mens sekvensielt injiserer opptil fire forbindelser eller reagenser; Dette muliggjør måling av flere cellulære respirasjonsparametere, for eksempel basal mitokondriell OCR, ATP-bundet OCR og maksimal mitokondriell OCR. Forbindelsene som ble injisert under målingene for protokollen vist her, var arbeidskonsentrasjoner på 10 mM pyruvat i den første løsningsbrønnen (port A), 20 μM oligomycin i den andre løsningsbrønnen (port B), 10 μM karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy) fenylhydrazon (FCCP) i den tredje brønnen (port C) og 20 μM antimycin A i den fjerde brønnen (port D), basert på Fried et ^al.25. Det må bemerkes at disse konsentrasjonene var arbeidskonsentrasjoner, og stamløsninger på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x ble injisert i løsningsportene A til D. Hensikten med å bruke hver løsning var som følger: 1) Pyruvat var nødvendig siden uten det ville tilsetningen av FCCP ha en redusert OCR-respons forårsaket av en begrensning av tilgjengelige substrater; 2) Oligomycin hemmer ATP-syntase og tillater måling av ATP-koblet respirasjon; 3) FCCP kobler oksidasjon fra fosforylering og tillater måling av maksimal mitokondriell kapasitet; 4) Antimycin A hemmer kompleks III i elektrontransportkjeden og tillater derfor måling av OCR som ikke er knyttet til mitokondriene.

Konsentrasjonen av oligomycin som ble brukt ble bestemt ut fra følgende årsaker: 1) Den anbefalte dosen av oligomycin for de fleste celletyper (isolerte mitokondrier eller cellekulturer) er 1,5 μM. Av erfaring brukes vanligvis 3x-10x av dissosierte celledosen til skiveeksperimentene, siden det kan være en gradient, og penetrasjonen av løsningen i skivene tar tid. Derfor bør konsentrasjonen ligge i området 5 μM til 25 μM. 2) En konsentrasjon på 20 μM ble valgt basert på Fried et ^al.25. Høyere konsentrasjoner ble ikke forsøkt på grunn av oligomycins uspesifikke toksisitet. 3) I rapporten fra Underwood et ^al.26 gjorde forfatterne et titreringseksperiment for oligomycin og fant at doser på 6,25, 12,5, 25 og 50 μg / ml resulterte i lignende inhibering. Den høyere konsentrasjonen av oligomycin (50 μg/ml) hemmet ikke mer, men hadde større varians. 4) I vår observasjon synes den avgjørende faktoren å være oligomycins penetrerende evne. Det er vanskelig for oligomycin å trenge inn i vevet, og det er derfor det tar minst 7 til 8 sykluser for å nå platået, maksimal respons. Så lenge den når platået, antas inhiberingen å være maksimal.

En viktig teknisk utfordring ved å tilpasse den ekstracellulære fluksanalysatoren for måling av OCR i striatale skiver er å forhindre vevshypoksi. Siden bufferen ikke ble oksygenert under hele måleperioden (ca. 4 timer), var hypoksi et sentralt tema. Dette gjelder spesielt for tykkere vevsprøver, der oksygen ikke kan diffundere gjennom prøvene. For å overvinne dette problemet ble skiver seksjonert med en tykkelse på 150 μm, slik at omgivende oksygen kunne trenge inn i midten av hjerneskivene. I tillegg ble 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) tilsatt den pre-oksygenerte kunstige cerebrospinalvæskebufferen (ACSF), noe som gjorde det lettere å bestemme maksimal OCR, som tidligere antydet²³. Vi undersøkte om cellene var i live. Først ble Hoechst 33258 (10 μM) og propidiumjodid (10 μM) brukt til å undersøke om cellene var sunne under disse forholdene. Vi undersøkte deretter om medium spiny nevroner var funksjonelt sunne ved hjelp av patch-clamp-opptak. Vi vurderte videre om dopaminterminaler (DA) i striatale skiver var funksjonelt sunne ved å måle DA-frigjøring ved hjelp av hurtigskanningsvolammetri. Resultatene viste at striatale skiver som ikke var oksygenert (ACSF/BSA-gruppen) var like friske som den oksygenerte kontrollgruppen²⁴.

Vi testet deretter forskjellige kombinasjoner av skivetykkelse og slagstørrelse for å bestemme optimale striatale skiveforhold for fluksrespirasjonsanalysen. Dorsale striatale skiver med forskjellige tykkelser (150 μm og 200 μm) og stansestørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) ble brukt til OCR-analyse ved hjelp av analysatoren. Striatale skiver som var 150 μm tykke med en slagstørrelse på 1,5 mm i diameter hadde den høyeste koblingseffektiviteten og OCR innenfor et optimalt område for analysatoren²⁴.

Protocol

Alle prosedyrene, inkludert dyrearbeid, ble utført i henhold til nasjonale og internasjonale retningslinjer og ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Thomas Jefferson University. Mannlige FVB/NTac mus i alderen 3 til 14 måneder ble brukt. Følgende trinn ble utført i en ikke-steril setting, men det bør utvises forsiktighet for å holde alt så rent som mulig. MERK: Metoden som presenteres her ble etablert og brukt i forskningen rapportert av Zhi et al.24….

Representative Results

Det første trinnet i denne studien var å optimalisere skivetykkelsen og stansestørrelsen som ble brukt til å fjerne en del av striatum fra skiven (figur 3A). En skive på 150 μm tykkelse og en 1,5 mm slagstørrelse ga de beste resultatene bestemt av koblingseffektiviteten (Figur 3B-C). Som vist i figur 3B, er OCR relativt stabil i 5 timer med mindre enn 10% nedkjøring. I tillegg ble det brukt …

Discussion

Metoden vi utviklet tillot en XF-analysator å bli brukt til å måle OCR i striatale skiver fra voksne mus over et tidsrom på 4 timer. Denne metoden gir en ny måte å måle cellulær bioenergetikk i slag skåret ut fra anatomisk definerte hjernestrukturer. Siden vevsprøvene som analyseres er ganske små, kan de metabolske parametrene til bestemte hjerneområder involvert i en sykdom undersøkes. I tillegg etterligner bruk av akutte skiver nærmere det fysiologiske cellulære miljøet, som ikke kan oppnås med isolert…

Materials

Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions