Измерение потребления кислорода в острых полосатостных срезах взрослых мышей
Summary
Норма потребления кислорода (OCR) является общим показателем митохондриальной функции и может использоваться для изучения различных моделей заболеваний. Мы разработали новый метод с использованием анализатора Seahorse XF для непосредственного измерения OCR в острых полосатых срезах у взрослых мышей, который более физиологически актуален, чем другие методы.
Abstract
Митохондрии играют важную роль в клеточной продукции АТФ, регуляции активных форм кислорода и контроле концентрации Ca2+ . Митохондриальная дисфункция была вовлечена в патогенез множественных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера. Чтобы изучить роль митохондрий в моделях этих заболеваний, мы можем измерить митохондриальное дыхание через скорость потребления кислорода (OCR) в качестве прокси для функции митохондрий. OCR уже был успешно измерен в клеточных культурах, а также в изолированных митохондриях. Однако эти методы менее физиологически значимы, чем измерение OCR в острых срезах мозга. Чтобы преодолеть это ограничение, авторы разработали новый метод с использованием анализатора Seahorse XF для непосредственного измерения OCR в острых полосатых срезах у взрослых мышей. Методика оптимизирована с акцентом на полосатое тело, область мозга, участвующую в БП и болезни Гентингтона. Анализатор выполняет анализ живых клеток с использованием 24-луночной пластины, что позволяет одновременно проводить кинетическое измерение 24 образцов. Метод использует круговые перфорированные куски стриатальных срезов мозга в качестве образцов. Мы демонстрируем эффективность этой методики, выявляя нижний базальный OCR в полосатых срезах мышиной модели БП. Этот метод будет представлять широкий интерес для исследователей, работающих в области БП и болезни Гентингтона.
Introduction
Митохондриальная дисфункция была вовлечена в несколько неврологических заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера 1,2,3. Модели PD, такие как нокаутные мыши PINK1 (KO) и крысы, демонстрируют нарушение митохондриальной функции 4,5,6,7,8,9,10,11. Митохондрии, выделенные из полосатого тела (STR) или всего мозга стареющей мыши PINK1 KO, демонстрируют дефекты в комплексе I 7,10,12,13. Непосредственное измерение скорости потребления кислорода (OCR) является одним из наиболее распространенных методов оценки митохондриальной функции, поскольку OCR связан с продукцией АТФ, основной функцией митохондрий14. Таким образом, измерение OCR в моделях заболеваний или образцах / тканях, полученных от пациента, может помочь исследовать, как митохондриальная дисфункция приводит к заболеванию.
В настоящее время существует несколько способов измерения митохондриального OCR, включая электрод Кларка и другие электроды O2, флуоресцентный краситель O2 и внеклеточный анализатор потока 15,16,17,18,19. В качестве преимущества методы на основе электродов O2 позволяют легко добавлять различные подложки. Однако их недостаточно для одновременного измерения нескольких образцов. По сравнению с традиционными методами на основе электродовO2, внеклеточный анализатор потока, широко используемый инструмент для OCR в клеточных культурах или очищенных митохондриях, предлагает улучшенную пропускную способность 15,18,20. Тем не менее, все эти методы обычно применяются для измерения OCR в изолированных митохондриях или клеточных культурах 6,16,17,19,20,21. Выделение митохондрий вызывает непреднамеренное повреждение, а извлеченные митохондрии или клеточные культуры менее физиологически значимы, чем интактные срезы мозга22. Даже когда микроэлектроды используются в срезах, они менее чувствительны и более сложны в эксплуатации, чем в культивируемых клетках23.
Для решения этих задач мы разработали метод с использованием анализатора внеклеточного потока XF24, который позволяет анализировать множественные метаболические параметры острых полосатых срезов мозга мышей24. Этот метод обеспечивает непрерывную прямую количественную оценку митохондриального дыхания через OCR. Короче говоря, небольшие участки стриатальных срезов мозга помещаются в лунки островковой пластинки, а анализатор использует биосенсоры на основе кислорода и протонов на основе флуоресценций для измерения скорости OCR и внеклеточного подкисления соответственно 17,21,25.
Одной из уникальных особенностей анализатора являются четыре нагнетательные скважины, которые позволяют непрерывно измерять OCR при последовательной закачке до четырех соединений или реагентов; это позволяет измерять несколько параметров клеточного дыхания, таких как базальный митохондриальный OCR, ATP-связанный OCR и максимальный митохондриальный OCR. Соединения, введенные в ходе измерений по протоколу, показанному здесь, представляли собой рабочие концентрации пирувата 10 мМ в первой скважине раствора (порт А), 20 мкМ олигомицина во второй скважине раствора (порт В), 10 мкМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP) в третьей скважине (порт С) и 20 мкМ антимицина А в четвертой скважине (порт D), на основе Фрида и др.25. Следует отметить, что эти концентрации были рабочими концентрациями, и исходные растворы 10x, 11x, 12x и 13x вводились в порты раствора A-D соответственно. Цель использования каждого решения заключалась в следующем: 1) Пируват был необходим, поскольку без него добавление FCCP имело бы сниженную реакцию OCR, вызванную ограничением доступных субстратов; 2) Олигомицин ингибирует АТФ-синтазу и позволяет измерять АТФ-связанное дыхание; 3) FCCP отделяет окисление от фосфорилирования и позволяет измерять максимальную митохондриальную емкость; 4) Антимицин А ингибирует комплекс III в цепи переноса электронов и, следовательно, позволяет измерять OCR, не связанный с митохондриями.
Концентрацию используемого олигомицина определяли исходя из следующих причин: 1) Рекомендуемая доза олигомицина для большинства типов клеток (изолированных митохондрий или клеточных культур) составляет 1,5 мкМ. По опыту, обычно для экспериментов с срезом используется доза диссоциированных клеток 3х-10х, так как может быть градиент, а проникновение раствора в срезы требует времени. Поэтому концентрация должна быть в диапазоне от 5 мкМ до 25 мкМ. 2) Концентрация 20 мкМ была выбрана на основе Fried et al.25. Более высокие концентрации не были опробованы из-за неспецифической токсичности олигомицина. 3) В отчете Underwood et al.26 авторы провели эксперимент по титрованию олигомицина и обнаружили, что дозы в 6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мл приводили к аналогичному ингибированию. Более высокая концентрация олигомицина (50 мкг/мл) не ингибировала больше, но имела большую дисперсию. 4) По нашим наблюдениям, определяющим фактором, по-видимому, является проникающая способность олигомицина. Олигомицину трудно проникнуть в ткани, и именно поэтому требуется не менее 7 – 8 циклов, чтобы достичь плато, максимального ответа. До тех пор, пока он достигает плато, торможение считается максимальным.
Ключевой технической проблемой адаптации внеклеточного анализатора флюса для измерения OCR в стриатальных срезах является предотвращение гипоксии тканей. Поскольку буфер не насыщался кислородом в течение всей продолжительности измерений (около 4 ч), гипоксия была центральной проблемой. Это особенно верно для более толстых образцов тканей, где кислород не может диффундировать по всем образцам. Чтобы преодолеть эту проблему, срезы были разделены на толщину 150 мкм, чтобы окружающий кислород мог проникать в середину срезов мозга. Кроме того, 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) добавляли в буфер предварительно оксигенированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), что облегчало определение максимального OCR, как предлагалось ранее23. Мы исследовали, живы ли клетки. Во-первых, Hoechst 33258 (10 мкМ) и йодид пропидия (10 мкМ) были использованы для изучения того, являются ли клетки здоровыми в этих условиях. Затем мы изучили, являются ли средние колючие нейроны функционально здоровыми, используя запись зажимов. Мы также оценили, были ли терминалы дофамина (DA) в стриатальных срезах функционально здоровыми, измеряя высвобождение DA с помощью вольтамметрии быстрого сканирования. Результаты показали, что стриатальные срезы, которые не были насыщены кислородом (группа ACSF / BSA), были такими же здоровыми, как и контрольная группа24 с кислородом.
Затем мы протестировали различные комбинации толщины среза и размера перфоратора, чтобы определить оптимальные условия стриатального среза для анализа дыхания флюсом. Для анализа OCR с использованием анализатора использовались дорсальные стриатальные срезы различной толщины (150 мкм и 200 мкм) и размеров перфоратора (1,0 мм, 1,5 мм и 2,0 мм в диаметре). Стриатальные срезы толщиной 150 мкм с диаметром перфоратора 1,5 мм имели наивысшую эффективность соединения и OCR в оптимальном для анализатора24 диапазоне.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработанный нами метод позволил использовать XF-анализатор для измерения OCR в полосатых срезах взрослых мышей в течение 4 часов. Этот метод обеспечивает новый способ измерения клеточной биоэнергетики в ударах, вырезанных из анатомически определенных структур мозга. Поскольку анализ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Вангчена Церинга и Памелу Уолтер за их критическое прочтение и редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) (NS054773 для C.J. L. и NS098393 для H.Z.) и кафедрой неврологии в Университете Томаса Джефферсона (Startup Funds to H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Riferimenti
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
