Medición de la tasa de consumo de oxígeno en rodajas estriatales agudas de ratones adultos
Summary
La tasa de consumo de oxígeno (OCR) es un indicador común de la función mitocondrial y se puede utilizar para estudiar diferentes modelos de enfermedades. Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en rodajas estriatales agudas de ratones adultos que es más relevante fisiológicamente que otros métodos.
Abstract
Las mitocondrias juegan un papel importante en la producción celular de ATP, la regulación de especies reactivas de oxígeno yel control de la concentración de Ca 2+. La disfunción mitocondrial se ha implicado en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer. Para estudiar el papel de las mitocondrias en los modelos de estas enfermedades, podemos medir la respiración mitocondrial a través de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como un proxy de la función mitocondrial. El OCR ya se ha medido con éxito en cultivos celulares, así como en mitocondrias aisladas. Sin embargo, estas técnicas son menos relevantes fisiológicamente que la medición de OCR en cortes cerebrales agudos. Para superar esta limitación, los autores desarrollaron un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en cortes estriatales agudos de ratones adultos. La técnica está optimizada con un enfoque en el cuerpo estriado, un área del cerebro involucrada en la EP y la enfermedad de Huntington. El analizador realiza un ensayo de células vivas utilizando una placa de 24 pocillos, que permite la medición cinética simultánea de 24 muestras. El método utiliza piezas perforadas circularmente de cortes de cerebro estriatal como muestras. Demostramos la efectividad de esta técnica mediante la identificación de un OCR basal inferior en rodajas estriatales de un modelo de ratón de EP. Este método será de amplio interés para los investigadores que trabajan en el campo de la EP y la enfermedad de Huntington.
Introduction
La disfunción mitocondrial se ha implicado en varias enfermedades neurológicas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer 1,2,3. Los modelos de DP como los ratones y ratas PINK1 knockout (KO) muestran una función mitocondrial deteriorada 4,5,6,7,8,9,10,11. Las mitocondrias aisladas del cuerpo estriado (STR) o del cerebro entero del ratón PINK1 KO envejecido presentan defectos en el complejo I 7,10,12,13. La medición directa de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) es uno de los métodos más comunes para evaluar la función mitocondrial, ya que la OCR se combina con la producción de ATP, la función principal de las mitocondrias14. Por lo tanto, medir el OCR en modelos de enfermedad o muestras / tejidos derivados del paciente puede ayudar a investigar cómo la disfunción mitocondrial conduce a la enfermedad.
Actualmente, hay varias formas de medir el OCR mitocondrial, incluido el electrodo Clark y otros electrodos O2, el tinte fluorescente O2 y el analizador de flujo extracelular 15,16,17,18,19. Como ventaja, los métodos basados en electrodos O2 permiten agregar fácilmente varios sustratos. Sin embargo, son insuficientes para medir simultáneamente varias muestras. En comparación con los métodos tradicionales basados en electrodos de O2, el analizador de flujo extracelular, una herramienta comúnmente utilizada para OCR en cultivos celulares o mitocondrias purificadas, ofrece un rendimiento mejorado 15,18,20. Sin embargo, todos estos métodos se suelen aplicar para medir el OCR en mitocondrias aisladas o cultivos celulares 6,16,17,19,20,21. El aislamiento de las mitocondrias causa daños inadvertidos, y las mitocondrias extraídas o los cultivos celulares son menos relevantes fisiológicamente que las rebanadas cerebrales intactas22. Incluso cuando se utilizan microelectrodos en rodajas, son menos sensibles y más difíciles de operar que en células cultivadas23.
Para enfrentar estos desafíos, desarrollamos un método utilizando el analizador de flujo extracelular XF24, que permite el análisis de múltiples parámetros metabólicos a partir de cortes cerebrales estriatales agudos de ratones24. Esta técnica proporciona una cuantificación directa continua de la respiración mitocondrial a través del OCR. En resumen, pequeñas secciones de rebanadas de cerebro estriatal se colocan en los pocillos de la placa de los islotes, y el analizador utiliza biosensores basados en oxígeno y protones fluorescentes para medir la tasa de OCR y acidificación extracelular, respectivamente 17,21,25.
Una de las características únicas del analizador son los cuatro pozos de inyección, que permiten la medición continua de OCR mientras se inyecta secuencialmente hasta cuatro compuestos o reactivos; esto permite la medición de varios parámetros de respiración celular, como el OCR mitocondrial basal, el OCR ligado al ATP y el OCR mitocondrial máximo. Los compuestos inyectados durante las mediciones para el protocolo que se muestra aquí fueron concentraciones de trabajo de piruvato de 10 mM en el primer pozo de solución (puerto A), 20 μM de oligomicina en el segundo pozo de solución (puerto B), 10 μM de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) en el tercer pozo (puerto C), y 20 μM de antimicina A en el cuarto pozo (puerto D), basado en Fried et al.25. Cabe señalar que estas concentraciones eran concentraciones de trabajo, y las soluciones madre de 10x, 11x, 12x y 13x se inyectaron en los puertos de solución A a D, respectivamente. El propósito de usar cada solución fue el siguiente: 1) El piruvato era necesario ya que, sin él, la adición de FCCP tendría una respuesta de OCR disminuida causada por una limitación de los sustratos disponibles; 2) La oligomicina inhibe la ATP sintasa y permite la medición de la respiración ligada al ATP; 3) FCCP desacopla la oxidación de la fosforilación y permite la medición de la capacidad mitocondrial máxima; 4) La antimicina A inhibe el complejo III en la cadena de transporte de electrones y, por lo tanto, permite la medición de OCR no vinculado a las mitocondrias.
La concentración de oligomicina utilizada se determinó en base a las siguientes razones: 1) La dosis recomendada de oligomicina para la mayoría de los tipos celulares (mitocondrias aisladas o cultivos celulares) es de 1,5 μM. Por experiencia, generalmente se usan 3x-10x de la dosis de células disociadas para los experimentos de rebanadas, ya que puede haber un gradiente, y la penetración de la solución en las rebanadas lleva tiempo. Por lo tanto, la concentración debe estar en el rango de 5 μM a 25 μM. 2) Se seleccionó una concentración de 20 μM basada en Fried et al.25. No se probaron concentraciones más altas debido a la toxicidad inespecífica de la oligomicina. 3) En el informe de Underwood et al.26, los autores realizaron un experimento de titulación de oligomicina y encontraron que las dosis de 6,25, 12,5, 25 y 50 μg/ml dieron lugar a una inhibición similar. La mayor concentración de oligomicina (50 μg/ml) no inhibió más, pero tuvo una mayor varianza. 4) En nuestra observación, el factor determinante parece ser la capacidad de penetración de la oligomicina. Es difícil que la oligomicina penetre en el tejido, y es por eso que se necesitan al menos de 7 a 8 ciclos para alcanzar la meseta, la respuesta máxima. Mientras alcance la meseta, se supone que la inhibición es máxima.
Un desafío técnico clave de la adaptación del analizador de flujo extracelular para medir el OCR en rodajas estriatales es prevenir la hipoxia tisular. Dado que el tampón no se oxigenó durante toda la duración de las mediciones (aproximadamente 4 h), la hipoxia fue un problema central. Esto es especialmente cierto para las muestras de tejido más gruesas, donde el oxígeno no puede difundirse a través de las muestras. Para superar este problema, las rebanadas se seccionaron a 150 μm de espesor, de modo que el oxígeno ambiental pudiera penetrar en la mitad de las rebanadas cerebrales. Además, se agregaron 4 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) al tampón de líquido cefalorraquídeo artificial preoxigenado (ACSF), lo que facilitó la determinación de OCR máximo, como se sugirió anteriormente23. Examinamos si las células estaban vivas. En primer lugar, se utilizaron Hoechst 33258 (10 μM) y yoduro de propidio (10 μM) para examinar si las células estaban sanas en estas condiciones. Luego examinamos si las neuronas espinosas medianas estaban funcionalmente sanas mediante el registro de pinza de parche. Además, evaluamos si los terminales de dopamina (DA) en las rebanadas estriatales eran funcionalmente saludables midiendo la liberación de DA mediante voltamperometría de escaneo rápido. Los resultados mostraron que las rebanadas estriatales que no estaban oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eran tan saludables como el grupo control oxigenado24.
Luego probamos diferentes combinaciones de grosor de la rebanada y tamaño de punzón para determinar las condiciones óptimas de la rebanada estriatal para el ensayo de respiración de flujo. Se utilizaron rodajas estriatales dorsales con diferentes espesores (150 μm y 200 μm) y tamaños de punzonado (1,0 mm, 1,5 mm y 2,0 mm de diámetro) para el análisis de OCR utilizando el analizador. Las rodajas estriatales que tenían un grosor de 150 μm con un tamaño de punzonado de 1,5 mm de diámetro tenían la mayor eficiencia de acoplamiento y OCR dentro de un rango óptimo para el analizador24.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método que desarrollamos permitió utilizar un analizador XF para medir OCR en rodajas estriatales de ratones adultos durante un período de tiempo de 4 h. Este método proporciona una nueva forma de medir la bioenergética celular en punzones extirpados de estructuras cerebrales definidas anatómicamente. Dado que las muestras de tejido que se analizan son bastante pequeñas, se pueden investigar los parámetros metabólicos de áreas cerebrales específicas involucradas en una enfermedad. Además, el uso de rebanad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Wangchen Tsering y Pamela Walter por su lectura crítica y edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (NS054773 a C.J. L. y NS098393 a H.Z.) y el Departamento de Neurociencia de la Universidad Thomas Jefferson (Startup Funds a H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
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