Måling af iltforbrugshastighed i akutte striatale skiver fra voksne mus
Summary
Oxygenforbrugshastighed (OCR) er en fælles proxy for mitokondriefunktion og kan bruges til at studere forskellige sygdomsmodeller. Vi udviklede en ny metode ved hjælp af en Seahorse XF-analysator til direkte måling af OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus, der er mere fysiologisk relevant end andre metoder.
Abstract
Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellulær ATP-produktion, reaktiv iltartsregulering og Ca2+ koncentrationskontrol. Mitokondrie dysfunktion har været impliceret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons sygdom og Alzheimers sygdom. For at studere mitokondriernes rolle i modeller af disse sygdomme kan vi måle mitokondrie respiration via iltforbrugshastighed (OCR) som en proxy for mitokondriefunktion. OCR er allerede blevet målt med succes i cellekulturer såvel som isolerede mitokondrier. Disse teknikker er imidlertid mindre fysiologisk relevante end at måle OCR i akutte hjerneskiver. For at overvinde denne begrænsning udviklede forfatterne en ny metode ved hjælp af en Seahorse XF-analysator til direkte at måle OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus. Teknikken er optimeret med fokus på striatum, et hjerneområde involveret i PD og Huntingtons Sygdom. Analysatoren udfører et levende celleassay ved hjælp af en 24-brøndplade, som muliggør samtidig kinetisk måling af 24 prøver. Metoden bruger cirkulære stansede stykker striatale hjerneskiver som prøver. Vi demonstrerer effektiviteten af denne teknik ved at identificere en lavere basal OCR i striatale skiver af en musemodel af PD. Denne metode vil være af bred interesse for forskere, der arbejder inden for PD og Huntingtons Sygdom.
Introduction
Mitokondrie dysfunktion har været impliceret i flere neurologiske sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons sygdom og Alzheimers sygdom 1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) mus og rotter viser nedsat mitokondriefunktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isoleret fra striatum (STR) eller helhjerne hos alderen PINK1 KO mus udviser defekter i kompleks I 7,10,12,13. Direkte måling af iltforbrugshastigheden (OCR) er en af de mest almindelige metoder til at evaluere mitokondriefunktionen, da OCR er kombineret med ATP-produktion, mitokondriernes hovedfunktion14. Derfor kan måling af OCR i sygdomsmodeller eller patientafledte prøver/væv hjælpe med at undersøge, hvordan mitokondrie dysfunktion fører til sygdom.
I øjeblikket er der flere måder at måle mitokondrie OCR på, herunder Clark-elektroden og andreO2-elektroder,O2 fluorescerende farvestof og den ekstracellulære fluxanalysator 15,16,17,18,19. Som en fordel tilladerO2-elektrodebaserede metoder, at forskellige substrater let kan tilsættes. De er imidlertid utilstrækkelige til samtidig måling af flere prøver. Sammenlignet med traditionelleO2-elektrodebaserede metoder tilbyder den ekstracellulære fluxanalysator, et almindeligt anvendt værktøj til OCR i cellekulturer eller rensede mitokondrier, forbedret gennemstrømning 15,18,20. Ikke desto mindre anvendes alle disse metoder normalt til at måle OCR i isolerede mitokondrier eller cellekulturer 6,16,17,19,20,21. Isoleringen af mitokondrier forårsager utilsigtet skade, og ekstraherede mitokondrier eller cellekulturer er mindre fysiologisk relevante end intakte hjerneskiver22. Selv når mikroelektroder anvendes i skiver, er de mindre følsomme og vanskeligere at betjene end i dyrkede celler23.
For at imødekomme disse udfordringer udviklede vi en metode ved hjælp af XF24 ekstracellulær fluxanalysator, som giver mulighed for analyse af flere metaboliske parametre fra akutte striatale hjerneskiver af mus24. Denne teknik giver kontinuerlig direkte kvantificering af mitokondrie respiration via OCR. Kort sagt placeres små sektioner af striatale hjerneskiver i brønde på øpladen, og analysatoren bruger ilt- og protonfluorescerende baserede biosensorer til at måle OCR og ekstracellulær forsuringshastighed henholdsvis 17,21,25.
Et af de unikke træk ved analysatoren er de fire injektionsbrønde, som tillader fortsat måling af OCR, mens der sekventielt injiceres op til fire forbindelser eller reagenser; dette muliggør måling af flere cellulære respirationsparametre, såsom basal mitokondrie OCR, ATP-bundet OCR og maksimal mitokondrie OCR. De forbindelser, der blev injiceret under målingerne for protokollen vist her, var arbejdskoncentrationer på 10 mM pyruvat i den første opløsningsbrønd (port A), 20 μM oligomycin i den anden opløsningsbrønd (port B), 10 μM carbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) i den tredje brønd (port C) og 20 μM antimycin A i den fjerde brønd (port D), baseret på Fried et al.25. Det skal bemærkes, at disse koncentrationer var arbejdskoncentrationer, og stamopløsninger på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x blev injiceret i opløsningsportene A til D. Formålet med at anvende hver opløsning var som følger: 1) Pyruvat var nødvendigt, da tilsætning af FCCP uden det ville have et nedsat OCR-respons forårsaget af en begrænsning af tilgængelige substrater; 2) Oligomycin hæmmer ATP-syntase og tillader måling af ATP-bundet respiration; 3) FCCP afkobler oxidation fra phosphorylering og tillader måling af maksimal mitokondriekapacitet; 4) Antimycin A hæmmer kompleks III i elektrontransportkæden og tillader derfor måling af OCR, der ikke er knyttet til mitokondrierne.
Koncentrationen af anvendt oligomycin blev bestemt ud fra følgende årsager: 1) Den anbefalede dosis oligomycin for de fleste celletyper (isolerede mitokondrier eller cellekulturer) er 1,5 μM. Erfaringsmæssigt anvendes normalt 3x-10x af den dissocierede celledosis til skiveforsøgene, da der kan være en gradient, og indtrængningen af opløsning i skiverne tager tid. Derfor bør koncentrationen ligge i området fra 5 μM til 25 μM. 2) En 20 μM koncentration blev valgt baseret på Fried et al.25. Højere koncentrationer blev ikke forsøgt på grund af oligomycins ikke-specifikke toksicitet. 3) I rapporten fra Underwood et al.26 lavede forfatterne et titreringseksperiment for oligomycin og fandt ud af, at doser ved 6,25, 12,5, 25 og 50 μg / ml resulterede i lignende hæmning. Den højere koncentration af oligomycin (50 μg/ml) hæmmede ikke mere, men havde en større varians. 4) I vores observation synes den afgørende faktor at være oligomycins penetrerende evne. Det er svært for oligomycin at trænge ind i vævet, og derfor tager det mindst 7 til 8 cyklusser at nå plateauet, det maksimale respons. Så længe det når plateauet, antages inhiberingen at være maksimal.
En vigtig teknisk udfordring ved at tilpasse den ekstracellulære fluxanalysator til måling af OCR i striatale skiver er at forhindre vævshypoxi. Da bufferen ikke blev iltet i hele målingens varighed (ca. 4 timer), var hypoxi et centralt problem. Dette gælder især for tykkere vævsprøver, hvor ilt ikke kan diffundere gennem prøverne. For at overvinde dette problem blev skiverne snittet i en tykkelse på 150 μm, så omgivende ilt kunne trænge ind i midten af hjerneskiverne. Derudover blev der tilsat 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) til den præ-oxygenerede kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) buffer, hvilket lettede bestemmelsen af maksimal OCR, som tidligere foreslået23. Vi undersøgte, om cellerne var i live. For det første blev Hoechst 33258 (10 μM) og propidiumiodid (10 μM) anvendt til at undersøge, om cellerne var sunde under disse forhold. Vi undersøgte derefter, om mellemstore spiny neuroner var funktionelt sunde ved hjælp af patch-clamp-optagelse. Vi evaluerede yderligere, om dopamin (DA) terminaler i striatalskiverne var funktionelt sunde ved at måle DA-frigivelse ved hjælp af hurtigscanningsvolammetri. Resultaterne viste, at striatale skiver, der ikke var iltet (ACSF / BSA-gruppen), var lige så sunde som den iltede kontrolgruppe24.
Vi testede derefter forskellige kombinationer af skivetykkelse og stansstørrelse for at bestemme optimale striatale skivebetingelser for flux respirationsassay. Dorsale striatale skiver med forskellige tykkelser (150 μm og 200 μm) og stansestørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) blev anvendt til OCR-analyse ved hjælp af analysatoren. Striatale skiver, der var 150 μm tykke med en slagstørrelse på 1,5 mm i diameter, havde den højeste koblingseffektivitet og OCR’er inden for et optimalt område for analysatoren24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden, vi udviklede, gjorde det muligt at bruge en XF-analysator til måling af OCR i striatale skiver fra voksne mus over et tidsrum på 4 timer. Denne metode giver en ny måde at måle cellulær bioenergetik i slag udskåret fra anatomisk definerede hjernestrukturer. Da vævsprøverne, der analyseres, er ret små, kan de metaboliske parametre for specifikke hjerneområder, der er involveret i en sygdom, undersøges. Derudover efterligner anvendelse af akutte skiver tættere det fysiologiske cellulære miljø, hvilket…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Wangchen Tsering og Pamela Walter for deres kritiske læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 til C.J. L. og NS098393 til H.Z.) og Institut for Neurovidenskab ved Thomas Jefferson University (Startup Funds til H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Riferimenti
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
