Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması
Summary
Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.
Abstract
Kazanılmış kemo-direncin klinik olarak ilgili itici mekanizmalarını anlamak, akut miyeloid lösemili (AML) hastalarda direnci atlatmanın ve sağkalımı iyileştirmenin yollarını aydınlatmak için çok önemlidir. Kemoterapiden kurtulan lösemik hücrelerin küçük bir kısmı, kemoterapötik hakareti tolere etmek için hazır bir epigenetik duruma sahiptir. Kemoterapiye daha fazla maruz kalmak, bu ilaç persister hücrelerin sabit bir epigenetik duruma ulaşmasını sağlar, bu da değişmiş gen ekspresyonuna yol açar, bu da ilaca dirençli popülasyonların çoğalmasına ve sonunda nüks veya refrakter hastalığa neden olur. Bu nedenle, ilaca dirençli lösemik hücrelerin sağkalımını gerektiren epigenetik modülasyonların belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Kazanılmış bir sitarabin-dirençli AML hücre hattında havuzlanmış shRNA kütüphanesi taramasını kullanarak nükleozid analog sitarabin’e (AraC) dirence aracılık eden epigenetik modülatörleri tanımlamak için bir protokol detaylandırıyoruz. Kütüphane, yüksek verimli epigenetik faktör taramasına izin veren 407 insan epigenetik faktörünü hedefleyen 5.485 shRNA yapısından oluşmaktadır.
Introduction
Akut miyeloid lösemide (AML) terapötik seçenekler neredeyse son elli yıldır değişmeden kalmıştır ve sitarabin (AraC) ve antrasiklinler hastalığın tedavisinde temel taşı olarak kullanılmıştır. AML tedavisinin başarısındaki zorluklardan biri, lösemik kök hücrelerin kemoterapiye direncidir ve bu da hastalığın nüksetmesine yol açar 1,2. Epigenetik regülasyon kanser patogenezinde ve ilaç direncinde hayati bir rol oynamaktadır ve umut verici terapötik hedefler olarak çeşitli epigenetik faktörler ortaya çıkmıştır 3,4,5. Epigenetik düzenleyici mekanizmalar, kemoterapötik ilaçlara sürekli maruz kalma durumunda proliferasyonu ve sağkalımı etkilemektedir. Hematolojik olmayan malignitelerde yapılan çalışmalar, ilaç etkisinin üstesinden gelen hücrelerin küçük bir kısmının çeşitli epigenetik modifikasyonlara uğradığını ve bu hücrelerin hayatta kalmasına neden olduğunu bildirmiştir 6,7. Bununla birlikte, epigenetik faktörlerin AML’de sitarabina karşı edinilmiş dirence aracılık etmedeki rolü araştırılmamıştır.
Yüksek verimli tarama, zamanla küresel önem kazanmış ve hücresel mekanizmalarda, yol profillemede ve moleküler düzeydepotansiyel hedefleri tanımlamak için farklı yönlerden standart bir yöntem haline gelen ilaç keşfine bir yaklaşımdır 8,9. Sentetik öldürücülük kavramı, her iki genin de tek başına pertürbasyonunun canlı olduğu, ancak her iki genin aynı anda canlılık kaybına neden olduğu iki gen arasındaki etkileşimi içerir10. Kanser tedavisinde sentetik öldürücülüğün kullanılması, sağlam sentetik öldürücü genetik etkileşimlerin tanımlanmasına ve mekanik olarak karakterize edilmesine yardımcı olabilir11. AML’de edinilmiş sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörleri tanımlamak için sentetik öldürücülüğe sahip yüksek verimli shRNA taramasının kombinatoryal bir yaklaşımını benimsedik.
Karışık soy lösemi geninin (MLL veya KMT2A) kromozomal translokasyonu ile yönlendirilen akut lösemilerin, hastalarda kötü sağkalım ile ilişkili olduğu bilinmektedir. MLL gen yeniden düzenlemelerinin ortaya çıkan kimerik ürünleri, yani MLL füzyon proteinleri (MLL-FP’ler), hematopoetik kök / progenitör hücreleri (HSPC’ler) çoklu epigenetik faktörlerin katılımıyla lösemik patlamalara dönüştürebilir. Bu epigenetik düzenleyiciler, lösemi programının sürdürülmesini belirleyen karmaşık bir ağ oluşturur ve bu nedenle potansiyel terapötik hedefler oluşturabilir. Bu bağlamda, MV4-11 AraC R olarak adlandırılan edinilmiş sitarabin dirençli hücre hattını geliştirmek için MV4-11 hücre hattını (FLT3-ITD mutasyonu ile MLL füzyon geni MLL-AF4’ü barındıran; MV4-11 P olarak adlandırılır) kullandık. Hücre hattı, ilaç tatili olarak bilinen ilaç tedavisinden aralıklı iyileşme ile artan dozlarda sitarabin’e maruz kaldı. Yarı-maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) in vitro sitotoksisite testi ile değerlendirildi.
Bir pZIP lentiviral omurgaya sahip hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen havuzlanmış epigenetik shRNA Kütüphanesini (bkz. Bu kütüphane, 407 epigenetik faktörü hedefleyen shRNA’lardan oluşur. Her faktörde 5-24 shRNA bulunur ve beş hedeflemeyen kontrol shRNA’sı da dahil olmak üzere toplam 5.485 shRNA bulunur. Modifiye edilmiş “UltrmiR” miR-30 iskelesi, verimli primer shRNA biyogenezi ve ekspresyonu12,13 için optimize edilmiştir.
Bu deneyin ana hatları Şekil 1A’da gösterilmiştir. Mevcut protokol, bir süspansiyon hücre hattı olan MV4-11 AraC R hücre hattındaki epigenetik faktör shRNA kütüphanesini kullanarak RNAi taramasına odaklanmaktadır (Şekil 1B). Bu protokol, kişinin seçtiği herhangi bir ilaca dirençli hücre hattındaki hedeflenen herhangi bir kütüphaneyi taramak için kullanılabilir. Transdüksiyon protokolünün yapışkan hücreler için farklı olacağına dikkat edilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA girişimi (RNAi), siRNA ve shRNA taramasını içeren fonksiyonel genomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. ShRNA’nın yararı, plazmid vektörlerine dahil edilebilmeleri ve genomik DNA’ya entegre edilebilmeleri, böylece kararlı ekspresyon ve dolayısıyla hedef mRNA’nın daha uzun süreli nakavtıyla sonuçlanmalarıdır. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi taraması, geleneksel dizili ekranlara (siRNA) kıyasla sağlam ve uygun maliyetlidir. Genom çapında bir ekranda belirli bir protein sın?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen SRV’ye BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 hibe Biyoteknoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir; ve Biyoteknoloji Bölümü Hindistan BT / COE / 34 / SP13432 / 2015 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Hindistan: EMR / 2017 / 003880 ila P.B. RVS ve P.B. sırasıyla Wellcome DBT Hindistan İttifakı IA / S / 17/1 / 503118 ve IA / S / 15 / 1 / 501842 tarafından desteklenmektedir. S.D. CSIR-UGC bursu tarafından desteklenmektedir ve S.I. ICMR kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. Abhirup Bagchi, Sandya Rani ve CSCR Flow Cytometry Core Facility personeline yardımları için teşekkür ederiz. MedGenome Inc.’e de yüksek verimli dizileme ve veri analizine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
Riferimenti
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
