Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).
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Articolo metodologico
Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere i meccanismi driver clinicamente rilevanti della chemio-resistenza acquisita è fondamentale per chiarire i modi per aggirare la resistenza e migliorare la sopravvivenza nei pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Una piccola frazione di cellule leucemiche che sopravvivono alla chemioterapia hanno uno stato epigenetico pronto a tollerare l'insulto chemioterapico. Un'ulteriore esposizione alla chemioterapia consente a queste cellule persistenti di raggiungere uno stato epigenetico fisso, che porta a un'alterata espressione genica, con conseguente proliferazione di queste popolazioni resistenti ai farmaci e infine malattia recidivante o refrattaria. Pertanto, identificare le modulazioni epigenetiche che richiedono la sopravvivenza delle cellule leucemiche resistenti ai farmaci è fondamentale. Descriviamo in dettaglio un protocollo per identificare i modulatori epigenetici che mediano la resistenza all'analogo nucleosidico citarabina (AraC) utilizzando lo screening della libreria di shRNA aggregato in una linea cellulare AML resistente alla citarabina acquisita. La libreria è composta da 5.485 costrutti shRNA mirati a 407 fattori epigenetici umani, che consentono lo screening dei fattori epigenetici ad alto rendimento.
Introduzione
Le opzioni terapeutiche nella leucemia mieloide acuta (LMA) sono rimaste invariate per quasi gli ultimi cinque decenni, con citarabina (AraC) e antracicline come pietra angolare per il trattamento della malattia. Una delle sfide per il successo della terapia AML è la resistenza delle cellule staminali leucemiche alla chemioterapia, che porta alla recidivadella malattia 1,2. La regolazione epigenetica svolge un ruolo vitale nella patogenesi del cancro e nella resistenza ai farmaci, e diversi fattori epigenetici sono emersi come promettenti bersagli terapeutici 3,4,5
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Protocollo
Seguire le linee guida dell'Institutional Biosafety Committee (IBSC) e utilizzare la struttura appropriata per gestire il lentivirus (BSL-2). Il personale deve essere adeguatamente addestrato alla manipolazione e allo smaltimento del lentivirus. Questo protocollo segue le linee guida sulla biosicurezza del Christian Medical College, Vellore.
1. Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA
NOTA: È essenziale eseguire un esperimento di trasduzione utilizzando vettori lentivirali con diversi promotori che esprimono proteine di fluorescenza per id....
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Risultati
Il flusso di lavoro di screening complessivo è illustrato nella Figura 1A. La citotossicità in vitro dell'AraC R MV4-11 (48 h) ha rivelato che l'IC50 alla citarabina nell'MV4-11 AraC R è superiore all'MV4-11 P (Figura 1B). Questa linea cellulare è stata utilizzata nello studio come modello per lo screening dei fattori epigenetici responsabili della resistenza alla citarabina.
La Figura 2A.......
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Discussione
L'interferenza dell'RNA (RNAi) è ampiamente utilizzata per gli studi di genomica funzionale, che includono lo screening di siRNA e shRNA. Il vantaggio dello shRNA è che possono essere incorporati in vettori plasmidici e integrati nel DNA genomico, con conseguente espressione stabile e, quindi, abbattimento più prolungato dell'mRNA bersaglio. Uno screening della libreria shRNA in pool è robusto ed economico rispetto agli schermi arrayed convenzionali (siRNA). Identificare l'essenzialità di una specifica classe di proteine.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse e nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è finanziato in parte da una sovvenzione del Dipartimento di Biotecnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; e Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 e Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS e P.B. sono supportati rispettivamente da Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842. S.D. è supportato dalla borsa di studio CSIR-UGC e S.I. è supportato da una borsa di ricerca senior ICMR. Ringraziamo Abhirup Bagchi, Sandya Rani e lo staff del CSCR Flow Cytometry Core Facility per il loro aiuto. Ringraziamo anche MedGenome Inc. per l'aiuto con il sequenziamento ad alto throughput e l'analisi d....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarosio | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaina (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Acido Borico | Qualigens | 12005 | |
| Plastica per colture cellulari | Corning | come appicable | |
| Citosina β-D-arabinofuranoside cloridrato | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Bromuro | di etidioSigma | E1510-10 mL | |
| Fetale Bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Kit di Purificazione Gel/PCR | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Acido acetico glaciale | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmide | Transomics | TransOmics Selezione del promotore KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Selezione del promotore KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Linea cellulare HL60 | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polimerasi | Merck | 71086 | |
| Linea cellulare Molm13 | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| Linea cellulare MV4-11 | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillina streptomicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| psPAX2 e pMD2.G | Addgene Addgene | plasmide n.12260 & Addgene plasmide n. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Kit di test | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lotto n.: A116. V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus Mirus | Numero di catalogo: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra provette per centrifuga | Beckman Coulter | 103319 | |
| Attrezzature | |||
| 5% CO2 incubatore | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III selezionatore cellulare | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coltro Optima L-100K- Ultracentrifugazione | Centrifuga coltro | ||
| Thermo Multiguge 3SR+ | |||
| Sistema di imaging ChemiDoc ( Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | |||
| Leica Microscopio ottico | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorimetro | Invitrogen | ||
| Termociclatore | BioRad |
Riferimenti
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(201....
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Ristampe e permessi
