Sistema microfisiologico epatico umano per la valutazione della tossicità epatica indotta da farmaci in vitro

Summary

Il danno epatico indotto da farmaci (DILI) è una delle principali cause di fallimento farmacologico. È stato sviluppato un protocollo per prevedere con precisione la responsabilità DILI di un composto utilizzando un sistema microfisiologico epatico (MPS). Il modello epatico utilizza la cocoltura di cellule epatiche primarie ed endpoint traslazionali rilevanti per valutare le risposte cellulari al trattamento.

Abstract

DILI è una delle principali cause di logoramento nello sviluppo di farmaci con oltre 1000 farmaci approvati dalla FDA noti per causare potenzialmente DILI negli esseri umani. Sfortunatamente, il DILI spesso non viene rilevato fino a quando i farmaci non hanno raggiunto le fasi cliniche, mettendo a rischio la sicurezza dei pazienti e portando a perdite sostanziali per l'industria farmaceutica. Tenendo conto del fatto che i modelli 2D standard hanno limitazioni nel rilevamento di DILI, è essenziale sviluppare modelli in vitro che siano più predittivi per migliorare la traducibilità dei dati. Per comprendere in dettaglio la causalità e gli aspetti meccanicistici del DILI, è stata sviluppata una MPS epatica umana costituita da cellule parichimale e non parenchimali (NPC) epatiche primarie umane e coltivate in microtessuti 3D su un'impalcatura ingegnerizzata sotto perfusione. Gli epatociti umani primari crioconservati (PHH) e le cellule di Kupffer (HKC) sono stati cocoltivati come microtessuti nella piattaforma MPS per un massimo di due settimane e ogni composto di interesse è stato ripetutamente dosato su microtessuti epatici a sette concentrazioni di prova per un massimo di quattro giorni. Sono stati analizzati gli endpoint funzionali specifici del fegato (inclusi biomarcatori clinici come l'alanina aminotransferasi, ALT) per valutare la funzionalità epatica. L'esposizione acuta e cronica a composti di varia gravità DILI può essere valutata confrontando le risposte a microtessuti monodose e multidose. La metodologia è stata validata con un'ampia gamma di composti gravi e lievemente epatotossici. Qui mostriamo i dati relativi a pioglitazone e troglitazone, noti composti epatotossici ritirati dal mercato per aver causato insufficienza epatica. Nel complesso, è stato dimostrato che il modello MPS epatico può essere uno strumento utile per valutare la DILI e la sua associazione con i cambiamenti nella funzionalità epatica. Il modello può inoltre essere utilizzato per valutare come si comportano nuovi composti in sottogruppi di pazienti distinti e come i profili di tossicità possono essere influenzati da stati di malattia epatica (ad esempio, epatite virale, malattia del fegato grasso).

Introduction

DILI rimane la causa più comune di insufficienza epatica acuta negli Stati Uniti e in Europa ed è una delle principali cause di attrito dei composti nel processo di sviluppo del farmaco¹. Quasi tutte le classi di farmaci possono causare epatotossicità, con agenti del sistema nervoso centrale e antibiotici che sono di gran lunga i trattamenti più comuni che causano DILI nei pazienti². L'epatotossicità indotta da farmaci è causata da una complessa interazione di fattori genetici, non genetici e ambientali, che porta alla morte degli epatociti e di altri tipi di cellule del fegato, inclusi colangiociti e cellule endoteliali ^1,3.

Gli agenti che causano DILI possono essere classificati in due modi: quelli che causano danni epatici dose-dipendenti prevedibili o quelli che causano DILI idiosincratico che è raro e si sviluppa indipendentemente dalla dose del farmaco, o via, o durata della somministrazione, ma è responsabile fino a un sesto di tutti gli errori epatici acuti negli Stati Uniti solo⁴. Sfortunatamente, DILI spesso non viene rilevato fino a quando i farmaci non hanno raggiunto le fasi cliniche del processo di sviluppo del farmaco. Il grado di danno epatico indotto da farmaci (o DILIrank) consiste di oltre un migliaio di farmaci approvati dalla FDA che sono divisi in quattro classi in base al loro potenziale di causare DILI e il loro uso nei pazienti deve essere attentamente monitorato⁵.

Lo studio dei meccanismi di epatotossicità dei farmaci rimane molto impegnativo e, pertanto, sono stati sviluppati molti modelli preclinici per esplorare i meccanismi del DILI. Gli attuali modelli in vitro e in vivo utilizzati per prevedere DILI nello sviluppo preclinico hanno diverse limitazioni nel fornire approfondimenti sulle interazioni complesse e sfaccettate in un corpo umano vivente. Le linee cellulari epatiche cancerose (cioè HepG2, HepaRG) coltivate in 2D sono ancora utilizzate nelle prime fasi dello sviluppo di farmaci per valutare la tossicità dei composti candidati⁶. Anche così, queste linee cellulari provengono da singoli donatori e mostrano livelli anormali di funzionalità epatica e non sempre mostrano un'elevata sensibilità per il rilevamento di DILI ^7,8. In alternativa alle linee cellulari epatiche cancerose, i PHH rappresentano meglio la fisiologia epatica umana se coltivati in modo appropriato in vitro, sebbene esistano diverse limitazioni con la loro coltura, come un breve tempo di incubazione con farmaci, una durata relativamente breve, perdita di espressione genica epatica e cambiamenti delle funzioni metaboliche dei farmaci 9,10,11 . I PHH possono essere coltivati su proteine della matrice extracellulare in piastre di coltura cellulare 2D standard, ma come svantaggio, il rapido declino della loro funzione significa che hanno una bassa sensibilità (<50%) per la previsione DILI¹².

D'altra parte, i test su modelli animali sono lenti, costosi e necessitano di una traduzione interspecie per estrapolare la previsione agli esseri umani. La maggior parte dei farmaci di nuova concezione non riesce a ottenere l'approvazione, rendendo questo processo costoso e rischioso⁵. Inoltre, per testare nuove modalità specifiche per l'uomo, i modelli animali sono meno adatti a causa della sequenza genica o delle differenze di risposta immunologica rispetto agli esseri umani¹³.

Di conseguenza, l'interesse per i modelli epatici in vitro tridimensionali (3D) più avanzati è cresciuto esponenzialmente. La coltura di PHH come strutture sferoidali generate dall'aggregazione gravitazionale in gocce sospese o su superfici di attacco ultrabasse rappresenta un metodo ad alto rendimento per valutare le passività composte¹⁴. Gli sferoidi PHH sono stati utilizzati per valutare DILI in un contesto malato (ad esempio, steatosi e colestasi)¹⁵. Un'ampia varietà di modelli è stata sviluppata per includere cocolture micro-modellate placcate di epatociti con fibroblasti stromali¹⁶, tessuti epatici biostampati 3D¹⁷, colture sferoidi 3D con o senza cellule epatiche non parenchimali¹⁵. Tuttavia, tutti questi metodi presentano ancora degli svantaggi e la coltura di PHH in un microambiente più fisiologicamente rilevante potrebbe fornire loro livelli più elevati di funzionalità per lunghi periodi di tempo per consentire lo studio dell'esposizione prolungata a potenziali epatotossici. Inoltre, per migliorare la rilevanza traslazionale di qualsiasi coltura avanzata di PHH in vitro , devono essere utilizzati endpoint funzionali clinicamente rilevanti o biomarcatori di tossicità per consentire il confronto dei dati in vivo o negli scenari clinici¹⁸.

In questo studio, abbiamo valutato se un modello di fegato in vitro MPS, noto anche come Organ-on-a-Chip (OOC), potesse essere utilizzato per comprendere gli aspetti meccanicistici dettagliati della tossicità epatica. In precedenza è stato dimostrato che l'MPS mantiene microtessuti epatici 3D altamente funzionali, sotto flusso, fino a 4 settimane¹⁹. Il sistema è stato recentemente testato dalla FDA e ha dimostrato di avere un'elevata riproducibilità durante l'esecuzione di tossicità farmacologica, metabolismo e accumulo intracellulare²⁰. Inoltre, rispetto agli sferoidi e alle colture sandwich, il sistema aveva una funzione più stabile e una maggiore sensibilità nel rilevare la tossicità di diversi farmaci²⁰. Ad oggi, l'MPS è stato utilizzato in un'ampia gamma di applicazioni che coprono ADME 21, modelli di malattia (HBV 22, NAFLD 23,24,25) e interazioni farmaco-farmaco ^26, rendendolo potenzialmente altamente adatto alla valutazione della DILI acuta e cronica. La tecnologia qui presentata offre un'alternativa per colmare il divario tra colture cellulari più tradizionali e modelli animali e studi clinici sull'uomo, avanzando verso la simulazione delle condizioni biologiche umane per supportare la valutazione della tossicità epatica dei composti candidati nelle fasi precliniche del processo di sviluppo del farmaco.

Protocol

Tutto il lavoro è stato condotto in laboratorio seguendo rigorose procedure di salute e sicurezza e in conformità con le proprie valutazioni dei rischi di laboratorio e SOP. Tutte le attrezzature utilizzate sono revisionate secondo le linee guida del produttore. Gli armadi di sicurezza microbiologica (MBSC) vengono sottoposti a manutenzione annuale e Ki-Discus (ioduro di potassio) testato secondo gli standard britannici. Il protocollo segue il codice di condotta e le direttive della Human Tissue Authority (HTA) del Regno Unito e utilizza cellule umane primarie di provenienza etica fornite da fornitori che soddisfano pienamente i requisiti generali per il consenso informato (45 CFR § 46.116 e § 46.117) e la buona pratica clinica (GLP), (ICH E6) e comitati normativi ed etici.

1. Preparazione dei terreni di coltura cellulare

NOTA: Preparare il terreno di semina avanzato DMEM il giorno -1 e conservare a 4 °C. Preparare il mezzo DMEM avanzato di manutenzione il giorno 1 e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.

1. Semina Terreno DMEM avanzato per cocultura PHHs e HKC: Integrare un flacone di mezzo DMEM avanzato da 500 mL (Table of Materials) con 18 mL di Cocktail A (concentrazione finale del 3,6%) e con 25 mL di FBS (concentrazione finale 5%).
2. Mantenimento Terreno DMEM avanzato per cocultura PHH e HKC: Integrare un flacone di mezzo DMEM avanzato da 500 ml (tabella dei materiali) con 20 ml di Cocktail B (concentrazione finale del 4%) e idrocortisone da 500 nM.
   NOTA: L'idrocortisone sarà preparato fresco il giorno dell'uso e i passaggi su come preparare la soluzione madre e le diluizioni richieste sono indicati di seguito.
3. Preparazione di idrocortisone 500 nM in Maintenance Advanced DMEM Medium
   1. Preparazione della soluzione madre di partenza (20 mM): pesare 7,24 mg di idrocortisone (Tabella dei materiali) in un flaconcino di vetro da 1 mL. Registrare la quantità esatta di idrocortisone pesata e determinare il volume di dimetilsolfossido (DMSO) utilizzando il seguente calcolo:
      
   2. Preparazione della soluzione madre di idrocortisone da 100 μM di lavoro: aggiungere 5 μL della soluzione madre iniziale da 20 mM a 995 μL di DMEM avanzato.
      NOTA: Diluendo 25 μL della soluzione di DMSO dal punto 1 in acqua o mezzi si ottiene una concentrazione di DMSO dello 0,5%. Nella soluzione finale, la concentrazione di DMSO sarà dello 0,0025%. In questo caso, il volume aggiuntivo di 5 μL comporta una variazione insignificante del volume totale.
   3. Preparazione della soluzione di idrocortisone da 500 nM di lavoro in Advanced DMEM: Per preparare 1 mL di soluzione di idrocortisone 500 nM in Advanced DMEM, aggiungere 5 μL della soluzione madre di 100 μM di idrocortisone a 995 μL del mezzo DMEM avanzato di mantenimento.

2. Configurazione e priming MPS (Giorno -1)

1. Collegare il controller alla sua docking station in un incubatore di coltura cellulare e assicurarsi che l'essiccante fresco (Table of Materials) sia aggiunto nel barattolo di essiccazione situato sul retro del controller.
   NOTA: L'unità di controllo aspira l'umidità dall'incubatore nel tempo e viene mantenuta asciutta utilizzando essiccante fresco.
2. Accendere il controller premendo l'interruttore a bilanciere situato dietro di esso e attendere 5 minuti affinché il sistema si stabilizzi e raggiunga la pressione. Quindi controllare lo schermo per il rapporto pneumatico per assicurarsi: (i) L'uscita del serbatoio di pressione ha raggiunto ~ 2000 mBar e (ii) l'uscita del serbatoio del vuoto ha raggiunto ~ 850 mBar.
3. Rimuovere ogni piastra dalla confezione e ispezionare visivamente ogni pozzetto per verificare eventuali difetti (impalcature mancanti, crepe, ecc.).
4. Inserire un driver (con una targhetta) nell'alloggiamento di espansione per verificare che il driver sia riconosciuto dalla docking station e dal controller. Verificare che l'uscita del serbatoio di pressione sia diminuita di meno di 100 mBar e che l'uscita del serbatoio del vuoto sia aumentata di meno di 500 mBar.
5. Innescare ogni pozzetto aggiungendo 500 μL di terreno DMEM Seeding Advanced (preriscaldato a 37 °C) sul lato del serbatoio.
6. Selezionare il programma Prime sullo schermo del controller (flusso ascendente per 3 minuti a 2,5 μL/s) fino a quando il fluido non passa attraverso i supporti del filtro. NOTA: 'Up flow' è un'impostazione sul controller che consente al fluido di fluire dal serbatoio verso l'alto attraverso gli scaffold nella piastra LC12.
7. Riempire tutti i pozzetti con altri 1,1 ml di terreno DMEM Seeding Advanced per coprire il canale superficiale. Tutti i pozzi saranno quindi al loro pieno volume di lavoro di 1,6 ml.
8. Posizionare i driver con piastre in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂ , collegarli alla docking station ed eseguire il programma di incubazione .
   NOTA: Tutti i programmi utilizzati nell'esperimento (Prime, Incubate, Seed, Media Change) sono preimpostati nel sistema MPS. Innescare i piatti nell'incubatrice fino al momento del seme.

3. Seminare cellule epatiche nelle MPS (Giorno 0)

1. Preconvalidare tutti i PHHS e HKC. Tutti i lotti di PHH e HKC sono pre-convalidati internamente prima di eseguire l'esperimento di coltura cellulare (vedi Materiale supplementare).
2. Scongelare i flaconcini di PHH e cellule HKC (Table of Materials) tenendo i flaconcini saldamente in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando rimane solo una piccola scheggia di ghiaccio.
3. Pipettare i PHH direttamente in una provetta di mezzo CHRM per il recupero degli epatociti crioconservato preriscaldato (37 °C) (massimo due flaconcini per tubo).
4. Pipettare delicatamente le cellule, quindi utilizzare 1 mL di CHRM per lavare eventuali cellule rimanenti dal criotubo. Sii molto delicato con le cellule quando scongela e trasferisci in un tubo conico.
   ATTENZIONE Non agitare i flaconcini durante lo scongelamento e non pipettare il loro contenuto su e giù.
5. Pipettare delicatamente le cellule HKC dal criotubo in 10 ml di terreno DMEM avanzato di semina ghiacciato in una provetta da centrifuga da 15 ml.
   NOTA: È possibile combinare fino a 2 flaconcini di HKC.
6. Centrifugare entrambi i tipi di celle a temperatura ambiente (RT) a 100 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante.
7. Risospendere i PHH nel mezzo DMEM avanzato di semina caldo e gli HKC nel mezzo DMEM avanzato di semina ghiacciato (per aiutare a ridurre l'aggregazione cellulare), utilizzando 1 ml per fiala di cellule aggiunte al tubo e posizionare le cellule sul ghiaccio. Usa una delicata azione oscillante per risospendere le cellule.
   ATTENZIONE: Non risospendere i PHH per azione pipetta, poiché può portare alla morte cellulare.
8. Combinare le sospensioni cellulari da più provette (se applicabile, cioè se tutti i PHH provengono dallo stesso donatore), ma non mescolare i tipi di cellule.
9. Contare le celle. Registrare la vitalità (deve essere superiore all'85% per entrambi i tipi di cellule, PHH e HKC) e il numero totale di cellule. Se la vitalità cellulare scende al di sotto dell'85%, scongelare una nuova fiala di cellule e rivalutare la vitalità cellulare.
10. Calcola la vitalità cellulare usando la seguente formula:
    
11. Calcolare il volume desiderato della sospensione cellulare da seminare in ciascun pozzetto e il volume aggiuntivo di semina Il mezzo DMEM avanzato necessario per portare il volume totale di semina a 400 μL. Numero di celle per pozzetto: 0,4 x 10 6 PHH e 0,04 x 10 6 HKC per pozzetto e densità cellulare di 0,25 x 10⁶ PHH/ml, rispettivamente 0,025 x 10⁶ HKC/mL.
12. Scollegare il driver dall'alloggiamento di espansione e inserirlo in MBSC.
13. Aspirare il fluido dall'impalcatura sopra al punto di arresto (scendendo lungo la tacca profonda sull'anello di contenimento), al canale e al serbatoio. Lasciare un "volume morto" di 0,2 ml nel pozzo della coltura, raggiungendo appena sopra l'impalcatura. Bisogna fare attenzione a non rimuovere il mezzo totale da sopra l'impalcatura per evitare la formazione di bolle d'aria.
14. Aggiungere 400 μL di mezzo DMEM Seeding Advanced nella camera del pozzo, riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma Media Change per 3 minuti. Il programma si interromperà automaticamente dopo 3 minuti.
15. Al termine, scollegare il driver dall'alloggiamento di espansione e reinserirlo in MBSC.
16. Aspirare il fluido dall'impalcatura di cui sopra fino al punto di arresto e all'estremità del serbatoio di ciascun pozzetto.
17. Risospendere con attenzione i PHH facendo oscillare delicatamente il tubo, quindi aggiungere il volume richiesto della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di coltura. Pipettare con attenzione la sospensione cellulare, assicurarsi che le cellule si disperdano uniformemente attraverso l'impalcatura della piastra.
    NOTA: per garantire una buona copertura durante l'impalcatura, utilizzare un movimento vorticoso lento per pipettare le celle sull'impalcatura.
18. Allo stesso modo, risospendere attentamente gli HKC e aggiungere le sospensioni cellulari a ciascun pozzetto di coltura.
    NOTA: utilizzare un movimento vorticoso lento per seminare HKC per garantire una buona copertura in tutta l'impalcatura. Le due fasi secondarie della semina possono essere separate, oppure i due tipi di cellule possono essere premiscelati ad una densità appropriata e seminati contemporaneamente.
19. Una volta che tutti i pozzetti contengono entrambi i tipi di celle, posizionare il driver MPS sulla docking station nell'incubatore senza collegarlo fisicamente e lasciarlo riposare per 1 ora.
20. Dopo 1 ora, riempire ogni pozzetto con il volume richiesto di terreno DMEM Seeding Advanced aggiuntivo per raggiungere 400 μL ed eseguire il programma Seed.
21. Dopo 2 minuti, il programma si interrompe automaticamente, rimuove il driver dall'incubatore e aggiunge lentamente 1000 μL del mezzo DMEM Seeding Advanced al canale (più vicino all'estremità del serbatoio rispetto alla camera del pozzo) per ottenere un volume totale di 1,4 ml (con un ulteriore volume morto di 200 μL nei canali).
22. Spostare le piastre nell'incubatore ed eseguire il resto del programma Seed per 8 ore.
    NOTA: Flow passerà automaticamente al programma di incubazione dopo 8 ore.

4. Cambiamento dei media (giorno 1)

1. Scollegare il driver dall'alloggiamento di espansione e inserirlo in MBSC.
2. Eseguire la modifica del supporto rimuovendo il mezzo DMEM Seeding Advanced nella camera del pozzo fino al punto di arresto.
3. Aggiungere 400 μL del mezzo DMEM Maintenance Advanced nella camera del pozzo, riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma Media Change per 3 minuti. Il programma si interromperà automaticamente dopo 3 minuti.
4. Scollegare il driver dalla docking station e, nell'MBSC, aspirare il fluido lontano dalla camera del serbatoio, dal canale e dal punto di arresto sopra l'impalcatura. A questo punto, il pozzo della cultura tornerà al volume morto.
5. Riempire la camera del serbatoio con 1,4 ml di materiale DMEM fresco preriscaldato (37 °C) Maintenance Advanced DMEM.
6. Riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma Incubate .

5. Controllo della qualità dei microtessuti epatici (QC), raccolta dei media, cambio dei media e dosaggio dei farmaci (giorno 4)

1. Il giorno 4 eseguire un cambio del supporto utilizzando il mezzo DMEM avanzato di manutenzione e controlli di controllo qualità per garantire che la semina abbia avuto esito positivo.
   NOTA: QC è un processo utilizzato per verificare la salute dei microtessuti formati misurando la lattato deidrogenasi (LDH) e l'urea.
2. Prima di eseguire il controllo qualità, preparare nuove soluzioni madre per ciascun composto da testare (in mezzo DMEM avanzato di manutenzione o mezzo DMEM avanzato di manutenzione contenente lo 0,1% di DMSO, a seconda della solubilità di ciascun composto). Preparare le diluizioni di conseguenza per ottenere le concentrazioni di prova per ciascun composto.
3. Scollegare il driver e la piastra dalla docking station e trasferirli a un MBSC.
4. Trasferire 50 μL di fluido da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta su una piastra a 96 pozzetti per eseguire un test LDH (Table of Materials) prima del campionamento e 25 μL per un saggio di urea (Table of Materials).
   NOTA: i saggi LDH e urea saranno eseguiti seguendo le istruzioni del produttore.
5. Continuare l'esperimento dopo QC se le letture LDH sono inferiori a 2 UA / 10 6 cellule e l'urea è superiore a 40 μg / giorno / 10⁶ cellule.
   NOTA: L'albumina non viene utilizzata come QC perché è un test lungo da eseguire il giorno e verrà analizzato in seguito una volta completato l'esperimento dai campioni prelevati il giorno 4.
6. Se alcuni pozzi falliscono il controllo qualità, rimuoverli dal progetto sperimentale.
7. Una volta confermato il layout sperimentale, campionare i mezzi rimanenti da ciascun pozzetto, assicurandosi di non disturbare la coltura cellulare toccando l'impalcatura. Conservare i terreni raccolti (etichettati come campioni pre-dose) a -80 °C per i test successivi.
8. Eseguire la modifica del supporto in un MBSC seguendo i passaggi 4.3-4.5. Cambiare i pozzetti in mezzo DMEM avanzato di manutenzione con la giusta concentrazione di farmaco in base al disegno sperimentale.
9. Al termine, riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma di incubazione .

6. Raccolta dei media, cambio dei media e dosaggio del farmaco (Giorno 6)

1. Preparare nuove soluzioni madre per ciascun composto da testare (sia in mezzo DMEM avanzato di manutenzione o mezzo DMEM avanzato di manutenzione contenente lo 0,1% di DMSO, a seconda della solubilità di ciascun composto). Preparare le diluizioni di conseguenza per ottenere le concentrazioni di prova per ciascun composto secondo il piano della piastra.
2. Scollegare il driver e la piastra dalla docking station e trasferirli a un MBSC.
3. Raccogliere i terreni da ciascun pozzetto (~1 ml) manualmente con una pipetta assicurandosi di non disturbare la coltura cellulare toccando lo scaffold, saggiare per LDH e Urea. Conservare il resto dei terreni raccolti a -80 °C per i test successivi ed etichettarli con campioni post-dose di 48 ore.
4. Ridosare ogni pozzetto con la stessa concentrazione di farmaco del giorno 4 e secondo il piano della piastra eseguendo il cambio del fluido seguendo i passaggi 4.3-4.5.
5. Al termine, riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma di incubazione .

7. Fine dell'esperimento (Giorno 8)

1. Scollegare il driver e la piastra dalla docking station e trasferirli a un MBSC.
2. Prelevare manualmente i supporti da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta, assicurandosi di non disturbare la coltura cellulare toccando l'impalcatura.
3. Dosare i terreni prelevati per LDH e Urea e conservare il resto dei terreni raccolti a -80 °C per i saggi successivi.
4. Esecuzione del test CYP3A4-glo.
   1. Misurare gli effetti dei farmaci testati sull'attività del citocromo P450 CYP3A4 nei PHH alla fine dell'esperimento utilizzando questo test.
   2. Ricostituire il reagente di rivelazione (per il test CYP3A4, vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore. Se il reagente rivelatore è stato precedentemente ricostituito e congelato, toglierlo dal congelatore a -20 °C e lasciarlo scongelare a RT.
   3. Preparare 20 mM stock D-luciferina standard seguendo le istruzioni del produttore.
   4. Preparare il substrato luminogenico di lavoro con una diluizione 1:1000 di Luciferin IPA in mezzo DMEM avanzato di mantenimento (2 ml di substrato luminogenico per pozzetto).
   5. Eseguire una modifica del supporto come descritto nei passaggi 4.3-4.5 con substrato luminogenico. Conservare 500 μL del substrato luminogenico in un flaconcino di vetro da 1,5 mL (Table of Materials) come materiale di input.
   6. Riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma di incubazione per 1,5 ore.
   7. Preparare la curva standard della D-luciferina in terreno di coltura in provette da 1,5 mL seguendo le istruzioni del produttore e pipettare 50 μL di ciascun standard in duplice copia su una piastra bianca opaca da 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali), utilizzando terreno di coltura come bianco o 0 μM.
   8. Una volta trascorso il tempo, rimuovere il driver dalla docking station e dal supporto campione per il test CYP3A4 seguendo i passaggi 7.4.9-7.4.13.
   9. Dopo l'incubazione, trasferire 50 μL del mezzo campione da ciascun pozzetto e materiale in ingresso alla piastra luminometrica bianca opaca a 96 pozzetti contenente gli standard. Fare attenzione a lasciare almeno due righe vuote sulla lastra opaca tra gli standard e i campioni per evitare un leggero trascinamento tra gli standard superiori e le letture dei campioni.
   10. Aggiungere 50 μL di reagente di rilevamento della luciferina a ciascun pozzetto per avviare una reazione luminescente.
   11. Incubare la piastra a RT su uno shaker per 20 minuti al buio per stabilizzare il segnale luminescente.
   12. Registrare la luminescenza utilizzando un luminometro o una telecamera CCD.
   13. Tracciate la curva standard prendendo la media di ciascun punto e sottraendo la media degli spazi vuoti. Utilizzare l'equazione della linea per calcolare il tasso metabolico (pmol/min/10⁶ cellule) nel resto dei campioni, ricordando di includere eventuali diluizioni fatte.
5. Rimuovere gli scaffold dalle piastre utilizzando un paio di pinzette e posizionarli in una piastra a 24 pozzetti contenente 500 μL di D-PBS (senza Ca++ e Mg++) in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non disturbare il microtessuto.
6. Scatta istantanee di ogni impalcatura usando un microscopio a luce invertita con ingrandimento 10x.
7. Eseguire il test ATP (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore:
   1. Scongelare il reagente a RT.
   2. Lavare i ponteggi due volte con 500 μL di D-PBS (senza Ca++ e Mg++) per ogni fase di lavaggio.
   3. Aggiungere 120 μL di reagente e 120 μL di PBS a ciascuna impalcatura e gli stessi volumi a un pozzetto vuoto (questo servirà come bianco). Posizionare la piastra ricoperta di foglio di alluminio su uno shaker e agitare vigorosamente (500 rpm) per 5 minuti seguiti da 30 minuti di incubazione per stabilizzare il segnale di luminescenza.
   4. Trasferire 100 μL dei campioni lisati in duplice copia su una piastra di dosaggio trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti per la misurazione. Assicurarsi che i pozzetti vuoti non siano posizionati accanto agli altri pozzetti di misurazione ad alta luminescenza.
   5. Registra la luminescenza utilizzando un lettore di micropiastre.
   6. Confrontare la luminescenza dei campioni con la luminescenza degli standard per determinare l'ATP rilevato dal reagente nei campioni.

Results

Il manoscritto descrive un modello di MPS epatico utilizzato per la valutazione del DILI. L'MPS facilita la generazione di microtessuti epatici 3D che vengono mantenuti altamente funzionali sotto flusso fino a 4 settimane. I PHH / HCM sono seminati su scaffold rivestiti di collagene per formare microtessuti epatici che vengono perfusi con un mezzo di crescita e, dopo aver superato il controllo QC, vengono dosati con composti. Qui, mostriamo i dati per troglitazone e pioglitazone, due composti strutturalmente simili ma con diversa gravità DILI.

Al giorno 4, prima della somministrazione del farmaco, viene valutato un controllo QC dei microtessuti epatici formati e consiste nel rilascio di LDH e nella sintesi dell'urea (Figura 1A). Il QC mira a confermare che l'MPS epatico produce microtessuti epatici altamente coerenti e funzionanti. I dati qui presentati sono generati da tre esperimenti e mostrano buoni livelli di riproducibilità con bassa variabilità intra e inter-studio. Dopo una coltura di 8 giorni, vengono valutate più metriche sanitarie ed epatiche (albumina, urea, CYP3A4, ATP) e i microtessuti di controllo mostrano alti livelli di funzionalità epatica e riproducibilità (Figura 1B,C). La microscopia in fase di contrasto e la colorazione IF dei microtessuti epatici (vedi materiale supplementare) mostrano un'elevata consistenza di semina attraverso i microcanali dello scaffold e rivelano la distribuzione di HKC nei microtessuti PHH (Figura 1D)

Figura 1: Le MPS epatiche producono dati altamente riproducibili e microtessuti coerenti. (A) Metriche 3D del controllo qualità dei microtessuti epatici al giorno 4 e valutazione della funzionalità alla fine dello studio al giorno 8 -(B) albumina e urea, (C) CY3A4 e ATP). I dati sono raccolti da 3 esperimenti; In ogni esperimento, c'erano 3 repliche di controllo del veicolo. I dati mostrati sono Media ± SD, N = 9. (D) Microscopia a contrasto di fase (10x e 20x) e IF di microtessuti epatici 3D generati dalla cocoltura di PHH e HKC nella piattaforma MPS epatica per la valutazione di DILI. Per visualizzare le HKC, prima della semina le HKC sono state trasdotte con un vettore adenovirale che esprime eGFP (vedi Materiale supplementare). Vengono mostrate fotomicrografie rappresentative. La trasduzione e l'imaging sono stati eseguiti come esperimento autonomo per dimostrare la localizzazione cellulare e non sono stati eseguiti con il protocollo DILI descritto. Le cellule HKC sono pre-convalidate internamente prima dell'uso in colture cellulari sperimentali e devono avere bassi livelli di attivazione post-disgelo; questo viene valutato misurando i biomarcatori IL-6 e TNF-alfa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Troglitazone è noto per causare gravi DILI; A seguito della sua licenza per il trattamento del diabete di tipo 2, è stato ritirato dalla FDA dopo 3 anni sul mercato a causa della frequenza di danno epatico associato al suo uso. Ad oggi, gli studi sugli animali pubblicati non sono riusciti a prevedere il potenziale di troglitazone di causare gravi lesioni epatiche. Anche la tossicità di questo composto non è stata rilevata nei saggi epatici 2D standard in vitro ¹⁴.

I microtessuti epatici nella MPS sono stati trattati con troglitazone per 96 ore e hanno causato una risposta tossica acuta, guidata da C max, che è stata rilevata dal rilascio di ALT e LDH e una rapida riduzione della produzione di albumina e urea, a circa 15 x C_max, in seguito all'esposizione acuta a troglitazone (Figura 2A). L'endpoint cellulare (contenuto di ATP) e l'attività del CYP3A4 (per valutare la biotrasformazione metabolica), campionati dopo 96 ore di esposizione, hanno ulteriormente confermato la tossicità causata da troglitazone e i valori di EC:50 erano altamente comparabili ad altri endpoint (Figura 2B). Le immagini al microscopio in campo chiaro effettuate dopo una coltura di 8 giorni nella MPS rivelano un microtessuto epatico sano, uniformemente seminato in tutto lo scaffold (controllo del veicolo) in contrasto con la morte/degradazione generalizzata del tessuto osservata nelle repliche trattate con controllo positivo e troglitazone alle prime due concentrazioni di prova (Figura 2C).

Figura 2: Determinazione del rischio DILI di troglitazone utilizzando endpoint epatotossici multipli. I microtessuti epatici sono stati esposti a sette concentrazioni di troglitazone per 96 ore e confrontati per (A) rilascio di LDH, rilascio di ALT, produzione di albumina, sintesi di urea, attività del CYP3A4 e contenuto di ATP. Linee blu - esposizione di 48 ore (solo endpoint multimediali), linee rosse - esposizione di 96 ore. Il controllo positivo è stato 100 μM di clorpromazina. Tutti gli endpoint sono misurati a partire dalle stesse colture epatiche di MPS. I dati mostrati sono medi ± SD, N = 3. (B) Riepilogo dei numeri E:50 generati dai dati. N.D. = dati non tracciabili. Linea = non dosata. (C) Microscopia rappresentativa in campo chiaro dei microtessuti epatici dopo coltura di 8 giorni (ingrandimento 10x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

È stata studiata anche la tossicità epatica in seguito all'esposizione a pioglitazone. Pioglitazone è un composto noto per essere di basso rischio DILI⁴ e non ha esercitato epatotossicità nelle classiche colture di epatociti primari 2D e anche in alcuni modelli 3D più avanzati^10,11. Lievi effetti epatotossici sono stati osservati in entrambi i punti temporali testati (Figura 3). Non è stato rilevato alcun rilascio di LDH o ALT; tuttavia, dopo 48 ore, è stata osservata una lieve riduzione della produzione di albumina e urea, a circa 25x C_max (Figura 3A). Una riduzione molto minore del contenuto di ATP è stata osservata anche ad alte concentrazioni di pioglitazone, ma ciò non è stato significativo. EC:50 valori generati dalle curve dose-risposta sono presentati nella Figura 3B. La microscopia ha rivelato una leggera alterazione del microtessuto dopo 96 ore di esposizione a pioglitazone alle due concentrazioni più alte testate (Figura 3C). I risultati dimostrano la capacità dell'MPS epatico di rilevare la tossicità di composti con lieve preoccupazione per DILI.

Figura 3: Determinazione del rischio DILI di pioglitazone utilizzando più endpoint epatotossici. I microtessuti epatici sono stati esposti a sette concentrazioni di pioglitazone per 96 ore e confrontati per (A) rilascio di LDH, rilascio di ALT, produzione di albumina, sintesi di urea, attività del CYP3A4 e contenuto di ATP. Linee blu - esposizione di 48 ore (solo endpoint multimediali), linee rosse - esposizione di 96 ore. Il controllo positivo è stato 100 μM di clorpromazina. Tutti gli endpoint sono misurati a partire dalle stesse colture epatiche di MPS. I dati mostrati sono medi ± SD, N = 3. (B) Riepilogo dei numeri EC:50 generati dai dati. N.D. = dati non tracciabili. Linea = non dosata. (C) Microscopia rappresentativa in campo chiaro dei microtessuti epatici dopo coltura di 8 giorni (ingrandimento 10x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Valutando tutti gli endpoint funzionali e i biomarcatori di tossicità che potrebbero rappresentare scenari in vivo o clinici (rilascio di LDH, sintesi di urea, produzione di albumina, attività del CYP3A4, contenuto di ATP, rilascio di ALT) e corroborando i dati generati per entrambi i composti testati dosati in un intervallo di dosaggio di sette punti per 48 ore e 96 ore, è stata generata una mappa di calore per produrre una "firma di epatotossicità", aiutare a identificare composti con diversi livelli di preoccupazione DILI (Figura 4).

Figura 4: Determinazione della "firma di tossicità" con MPS epatiche. Mappa termica che mostra troglitazone e pioglitazone da sei endpoint funzionali specifici per il fegato (rilascio di LDH, sintesi di urea, produzione di albumina, rilascio di ALT, attività del CYP3A4 e contenuto di ATP) dopo 48 ore e 96 ore di esposizione a un intervallo di dosi a sette punti. Ogni valore viene generato come media, N = 3 e normalizzato ai campioni di controllo. I valori sulle barre dei colori rappresentano un aumento di piegatura rispetto ai controlli della linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Materiale supplementare: Imaging al microscopio fluorescente di microtessuti e valutazione pre-qualifica delle cellule. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Le MPS sono progettate per ricapitolare le unità funzionali degli organi umani in vitro e sono state sviluppate per affrontare i limiti dei modelli convenzionali di coltura cellulare 3D²⁷. Il fegato è uno degli organi più modellati utilizzando MPS e sono stati sviluppati un'ampia varietà di sistemi. Il fegato umano è responsabile del metabolismo dei farmaci e della generazione di metaboliti tossici e la sua funzione è un elemento chiave per lo sviluppo di farmaci, compresa la valutazione della responsabilità DILI dei composti²⁸. Qui abbiamo introdotto un nuovo metodo per valutare DILI utilizzando una MPS epatica; il protocollo consente di cercare approfondimenti meccanicistici per ciascun composto analizzato per determinare come possa causare DILI oltre ad essere un test altamente sensibile e robusto. I microtessuti epatici si formano nelle piastre MPS, che sono una cocoltura di PHH e HKC e sono altamente funzionali con alti livelli di produzione di albumina e urea, nonché un'elevata attività del CYP3A4 rispetto ai modelli epatici standard in vitro ²⁰.

Sebbene il modello DILI qui descritto possa servire come strumento utile nelle fasi successive dei test preclinici nel processo di sviluppo del farmaco, ha anche diverse limitazioni. Come la maggior parte delle MPS attualmente disponibili sul mercato, è una piattaforma a basso rendimento e, quindi, più difficile da utilizzare per attività di screening dei farmaci su larga scala. Costituito da microtessuti formati dalla cocoltura di PHH e HKC, il modello DILI non può catturare interamente la complessità del fegato umano e un'ulteriore ottimizzazione incorporando diversi tipi di cellule (ad esempio, cellule immunitarie) sarebbe utile per aggiungere valore al modello esistente. Questa MPS monoorgano potrebbe anche essere combinata con altre piattaforme d'organo che possono condividere un mezzo comune e consentire la diafonia d'organo a livello cellulare o endocrino, e che possono aiutare a comprendere meglio le intuizioni meccanicistiche della tossicità non limitata solo al fegato stesso. Inoltre, come qualsiasi tecnologia relativamente nuova, potrebbe essere considerata costosa e quindi di accessibilità limitata.

MPS è una piattaforma utilizzata per sviluppare modelli organotipici di tessuti singoli o multi-umani. Il sistema è composto da un controller, un cavo ombelicale e un driver MPS in cui è inserita la piastra (Figura 5A). Ogni piastra MPS epatica ha 12 pozzetti aperti indipendenti per la coltura di cellule epatiche primarie in 3D su scaffold ingegnerizzati. In sintesi, il sistema è controllato QC e le piastre sono innescate al giorno -1, i PHH e gli HKC sono seminati sulle piastre al giorno zero (Figura 5B, vedi 1). Le micropompe incorporate facilitano la circolazione dei terreni di coltura cellulare attraverso gli scaffold per facilitare la formazione di microtessuti 3D (Figura 5B, vedi 2). I microtessuti formati sono QC'd al Giorno 4, dosati con diverse concentrazioni di ciascun composto ogni 48 ore per 4 giorni e analizzati per i biomarcatori endpoint al Giorno 8 (Figura 5C). La cronologia sperimentale del test DILI nella piastra MPS è illustrata nella Figura 5D.

Figura 5: Il sistema microfisiologico e la cronologia sperimentale di un saggio DILI standard. (A) Il sistema microfisiologico con i suoi componenti: controller (1), cavo ombelicale (2), docking station (3), driver MPS (4) e piastra LC12 (5). (B) La semina di PHH e HKC su piastra LC12 al giorno 1 (1) e micropompe incorporate facilitano la circolazione di terreni di coltura cellulare con portate regolabili attraverso i microtessuti 3D seminati sugli scaffold (2). (C) Smontaggio dei ponteggi alla fine dello studio. (D) Cronologia sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Quando si esegue il protocollo, è importante eseguire un robusto controllo QC del sistema prima dell'avvio, controllando che il sistema funzioni correttamente pneumaticamente e che le piastre consumabili siano ispezionate visivamente e innescate in modo efficiente per garantire una funzionalità uniforme su tutti i pozzi. Avere cellule umane primarie di alta qualità è essenziale per questo protocollo, con gli epatociti noti per aderire costantemente negli esperimenti di coltura cellulare e formare interazioni 3D. Anche lo scongelamento di queste cellule è un passo critico, poiché gli epatociti primari non devono essere risospesi dall'azione del pipettaggio in quanto ciò può portare rapidamente alla morte cellulare. Avere una vitalità cellulare superiore all'85% è fondamentale per il successo della semina, poiché grandi quantità di detriti cellulari interferiscono con la formazione di microtessuti 3D. Anche il controllo QC dei microtessuti epatici formati al giorno 4 è importante e l'utente deve assicurarsi che vengano misurati livelli accettabili di LDH e urea, poiché i parametri fuori gamma potrebbero essere indicativi della formazione di tessuti di scarsa qualità e consentire una risoluzione dei problemi diretta. Infine, l'idrocortisone utilizzato nei terreni di coltura cellulare deve essere preparato fresco il giorno dell'utilizzo per prevenire qualsiasi degradazione indesiderata che potrebbe influire sulla funzionalità della coltura cellulare, in quanto è necessario per mantenere la funzionalità metabolica degli epatociti.

Pur avendo una complessità significativa, la MPS epatica non contiene tutti i tipi di cellule del fegato umano. È possibile aggiungere ulteriori tipi di cellule al modello^24,29 per aumentare la rilevanza fisiologica^, ma questi dovrebbero essere aggiunti solo con una chiara giustificazione per il contesto di utilizzo. Per lo studio DILI PHH sono il tipo di cellula chiave, e l'incorporazione di HKC in questo modello consente di determinare alcune risposte immunologiche. Va anche notato che i PHH isolati da fegati umani e i PHH crioconservati disponibili in commercio tendono a dimostrare alcune variazioni da lotto a lotto. Abbiamo dimostrato qui che questo protocollo produce risultati riproducibili se utilizzato con preparati di cellule di alta qualità. Tuttavia, ci si aspetterebbe qualche variazione del lotto e questo potrebbe essere ulteriormente superato utilizzando lotti raggruppati di donatori multipli. Queste limitazioni potrebbero essere superate utilizzando cellule simili agli epatociti differenziate dalle iPSC che ricapitolano molte proprietà funzionali dei PHH e che sono state utilizzate nel processo di sviluppo del farmaco³⁰. Gli HKC mostrano anche molta variabilità e un alto livello di attivazione al momento del disgelo; pertanto, i donatori di HKC sono pre-validati internamente prima dell'uso in colture cellulari sperimentali (cocoltura con PHH convalidati) e devono avere bassi livelli di attivazione post-disgelo; questo viene valutato misurando i biomarcatori IL-6 e TNF-alfa (vedi Materiale supplementare).

I dati presentati qui confermano che il test può rilevare con precisione DILI, aiutando a identificare gli epatotossici che potrebbero non essere rilevati da 2D^10,11 e persino da alcuni modelli 3D. I dati generati dalle MPS non sono ancora utilizzati come standard dall'industria farmaceutica per le richieste normative o per scopi di screening dei farmaci a causa della mancanza di standardizzazione e armonizzazione dei processi, compresa la riproducibilità tra siti²⁰. I dati e gli approcci sperimentali qui dimostrati affrontano questo, dimostrando che il modello epatico può essere utilizzato di routine e robustamente negli schermi DILI per prevedere con precisione la responsabilità di nuovi composti.

Misurando una serie di endpoint per produrre una "firma di epatotossicità", aiutando a identificare composti con diversi livelli di preoccupazione DILI (compresi composti non rilevabili da altri metodi in vitro) e i loro meccanismi di tossicità rivelati. Questa tecnologia può colmare il divario tra la coltura cellulare tradizionale e i modelli animali da un lato e gli studi clinici sull'uomo, avanzando verso la simulazione delle condizioni biologiche umane per la valutazione preclinica della tossicità epatica come parte del processo di sviluppo del farmaco.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a grappolo per colture cellulari a 24 pozzetti, fondo piatto	Corning	3524
piastre per saggi trasparenti a 96 pozzetti, fondo piatto, plastica trasparente	Greiner	655101
piastre a 96 pozzetti, fondo piatto nero	Corning	3915
piastra inferiore a 96 pozzetti, superficie TC	ThermoScientific,	165306
Advanced DMEM (1x)	Gibco	12491015	Terreni di coltura cellulare.
Kit ELISA per albumina AssayMax	Diluizione	EA3201-1	1:250. Punto temporale Giorno 4, 6 e 8.
Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements)	Gibco	CM4000
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9682	Diluizione 1:1. Punto temporale Giorno 8.
Clorpromazina HCl	Sigma Aldrich	C8138
Coperchi blu Chromacol, fiala autocampionatore da 9 mm con filettatura a vite ThermoScientific	9-SCK(B)-ST1	fiale in vetro
Chromacol fiale da 9 mm in vetro trasparente con filettatura a vite	ThermoScientific	2-SVW
Classe 2 Cabine di sicurezza microbiologica - Trimat2 1500	scarico
Contained Air SolutionsProvette coniche 50 mL	Greiner	227261
Terreno di recupero degli epatociti crioconservati (CHRM)	ThermoFisher Scientific	Gibco CM7000
Epatociti umani primari crioconservati	BioIVT Europe	Lot. Kit
CytoTox 96	Promega	G1781	- nessuna. Punto temporale Giorno 4, 6 e 8
>Il modello di analisi dei dati utilizzato per generare il grafico e le curve EC:50 era la regressione non lineare (adattamento della curva) sigmoidale asimmetrica, 5PL, dove X è log(concentrazione	GraphPad Prism 9
Unità filtranti PES monouso 500 ml Fisher	Scientific	15913307
Bacini per pipette monouso 50 ml	Fisher Scientific	12369175
DMSO (dimetilsolfossido)	Sigma-Aldrich	Sigma D2650
Dulbeco' s Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca2+ e Mg2+ (D-PBS)	ThermoFisher Scientific	14190-144
Easy Reader Provette da centrifuga coniche in polipropilene 15 mL	Fisher Scientific	11889640
Siero bovino fetale	Gibco	10500064
Kit ELISA ALT umano	Abcam	ab 234578	Diluizione 1:5. Punto temporale Giorno 6 e 8.
Cellule Kupffer crioconservate umane	Lonza Europe	Lotto 190088KC
idrocortisone	Merck	H0888-1G
Modelli di incubatori: New Brunswick  Galaxy 170 S, Nuovo Brunswick Galaxy 170 R e CellXpert C170.	Eppendorf		Tutti i tagliandi vengono effettuati ogni anno; documenti disponibili su richiesta.
Microscopio invertito	Leica DMIL LED
MPS noto come Organ-on-a-Chip (OOC)	CN Bio Innovations Ltd.
Piastra MPS LC-12	CN Bio Innovations Ltd.
Neubauer Emocitometro monouso C-Chip migliorato (2 canali)	Cambridge Bioscience	DHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 Sistema di analisi e screening	Promega	V9002	Diluizione - nessuno. Punto temporale Giorno 8
Piattaforma MPS PhysioMimix	CN Bio Innovations Ltd.
Pioglitazone	MedChemExpress Tocris	HY-13956/CS-1700
Kit per il dosaggio dell'urea Quantichrom – Sistemi di bioanalisi	Sistemi di bioanalisi	DY970-05	Diluizione 1:2 se la lettura iniziale è troppo alta. Punto temporale Giorno 4, 6 e 8.
Gel di silice	Sigma-Aldrich	S7625
Il software utilizzato per analizzare e generare tutti i grafici era:	GraphPad Prism 9
Stripettes 10 mL	Fisher Scientific	11839660
Stripettes 25 mL	Fisher Scientific	11839181
Piastra di scongelamento Cocktail A, (Integratori primari per lo scongelamento e la placcatura degli epatociti)	Gibco	CM3000
Troglitazone	MedChemExpress Tocris	97322-87-7
Soluzione di Tripano Blu, 0,4%	Gibco	15250061
Provette 1,5 mL	Greiner	616201
Bilancia - modello PA214C e AV213C	Ohaus Corp