I den nuværende protokol anvendes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) teknikken til at bestemme kædelængdefordelingen (CLD) og den gennemsnitlige kædelængde (ACL) af glykogen.
Glykogenpartikler er forgrenede polysaccharider sammensat af lineære kæder af glucosylenheder bundet af α-1,4 glucosidbindinger. Sidstnævnte er fastgjort til hinanden ved hjælp af α-1,6 glucosidforbindelser, kaldet grenpunkter. Blandt de forskellige former for kulstoflagring (dvs. stivelse, β-glucan) er glykogen sandsynligvis et af de ældste og mest succesrige opbevaringspolysaccharider, der findes i hele den levende verden. Glucankæder er organiseret, så en stor mængde glukose hurtigt kan opbevares eller brændes i en celle, når det er nødvendigt. Talrige komplementære teknikker er blevet udviklet i løbet af de sidste årtier for at løse den fine struktur af glykogenpartikler. Denne artikel beskriver fluorofor-assisteret kulhydratelektroforese (FACE). Denne metode kvantificerer populationen af glucankæder, der komponerer en glykogenpartikel. Også kendt som kædelængdefordeling (CLD), afspejler denne parameter partikelstørrelsen og procentdelen af forgrening. Det er også et væsentligt krav til matematisk modellering af glykogenbiosyntese.
Glykogen, der anvendes som kulstof- og energilagring, er en homopolymer af glucose bestående af lineære kæder af glucosylenheder bundet af (1 → 4)-α bindinger og bundet gennem (1 → 6)-α glycosidbindinger eller forgreningspunkter. De fremstår som β- og α-partikler i cytosolen hos en lang række organismer. β er små vandopløselige partikler, der hovedsageligt observeres i prokaryoter. Deres diameter varierer fra 20-40 nm, sandsynligvis dikteret af glykogenmetaboliserende enzymer og sterisk hindring 1,2.
Først beskrevet i dyreceller viser de større α-partikler op til 300 nm i diameter med en blomkållignende form. Denne særlige organisation kan stamme fra aggregering af flere β-partikler eller kan opstå ved at spire ud af en enkelt β-partikel3. Interessant nok har en nylig undersøgelse rapporteret tilstedeværelsen af α-partikler i Escherichia coli4. I modsætning til α fra dyreceller falder sidstnævnte imidlertid hurtigt fra hinanden under ekstraktionsprocessen, hvilket kan forklare manglen på data i litteraturen4. Udseendet af α-partikler i eukaryoter og prokaryoter involverer fylogenetisk uafhængige glykogenmetaboliserende enzymer5. Dette rejser spørgsmål vedrørende sådanne partiklers funktion og arten af potentielle tværbindingsmidler mellem β-partikler5.
Selvom to modsatte matematiske modeller blev foreslået til dannelse af glykogenmolekyle 6,7,8,9, er det generelt accepteret, at β-partikler har udviklet sig som reaktion på deres metaboliske funktion som en yderst effektiv brændstofreserve til hurtig frigivelse af store mængder glukose. En stor mængde beviser tyder på, at glykogenegenskaber såsom fordøjelighed og opløselighed i vand er korreleret med den gennemsnitlige kædelængde (ACL), som derefter vil diktere procentdelen af forgreningspunkter og partikelstørrelsen 2,6,7,8,10,11 . ACL defineres ved forholdet mellem det samlede antal glucoserester og antallet af forgreningspunkter. ACL-værdierne varierer typisk fra 11-14 og 7-23 glucoserester i henholdsvis eukaryoter og prokaryoter10. Hos mennesker skyldes flere glykogenforstyrrelsessygdomme unormal glykogenakkumulering. For eksempel er Andersens sygdom forbundet med den mangelfulde aktivitet af et glykogenforgreningsenzym, hvilket resulterer i akkumulering af unormalt glykogen11. I prokaryoter tyder kumulative undersøgelser på, at ACL er en kritisk faktor, der påvirker nedbrydningshastigheden af glykogen og bakteriel overlevelsesevne12,13. Det er blevet rapporteret, at bakterier, der syntetiserer β-partikler med en lav ACL-værdi, nedbrydes langsommere og derfor modstår sulteforhold længere. Således er viden om arkitekturen af β-partikler afgørende for at forstå dannelsen af unormale glykogenpartikler i humane glykogenlagringssygdomme og prokaryoters overlevelse i et næringsstofmangelfuldt miljø.
Siden den første isolering af glykogen fra hundelever af den franske fysiolog Claude Bernard i slutningen af det nittende århundrede14 blev der udviklet mange teknikker til at karakterisere glykogenpartikler i detaljer. For eksempel transmissionselektronmikroskopi til glykogenmorfologi (α- eller β-partikler)15, proton-NMR-spektrometri til bestemmelse af procentdelen af α-1,6-forbindelser16, størrelsesudelukkelseskromatografi med multidetektorer til udledning af molekylvægten, fluoroforeseksuel elektroforese (FACE)17 eller højtydende anionbytterkromatografi med pulserende amperometrisk detektion (HPAEC-PAD) for både kædelængdefordeling (CLD) og ACL bestemmelse18.
Dette arbejde fokuserer på den fluoroforeassisterede kulhydratelektroforesemetode, som er afhængig af den reduktive aminering af hemiacetalgruppen ved primær aminfunktion. Historisk set blev 8-amino-1,3,6-naphthalen trisulfonsyre (ANTS) først brugt til mærkning. Senere blev den erstattet af den mere følsomme fluorofor, 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS)19.
Figur 1: Den reduktive amineringsreaktion med 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS). Reduktiv amineringsreaktion af hemiacetalgruppen ved primær aminfunktion af 8-amino 1,3,6 pyrentrisulfonsyre (APTS) under reduktive betingelser Klik her for at se en større version af dette tal.
Som afbildet i figur 1 interagerer den hemiacetale funktion af den reducerende ende af en glucankæde med den primære amin af APTS under reducerende betingelser. De sulfoniske grupper af APTS bærer negative ladninger, der muliggør adskillelse af glucankæder i henhold til deres polymerisationsgrad (DP). Den reduktive aminreaktion er yderst reproducerbar og effektiv. En gennemsnitlig effektivitetsmærkning på 80% opnås for DP3 til DP135 og op til 88% og 97% for henholdsvis maltose (DP2) og glucose17,20. Fordi et molekyle APTS reagerer med den reducerende ende af hver glucankæde, kunne individuelle kæder kvantificeres og sammenlignes med hinanden på molær basis.
De fysisk-kemiske egenskaber af glykogenpartikler (f.eks. Størrelse, morfologi, opløselighed) er direkte forbundet med længden af glucaner, der komponerer partiklerne. Enhver ubalance mellem biosyntetiske og katabolske enzymer resulterer i ændring af kædelængdefordelingen og i sig selv akkumulering af unormalt glykogen, der kan være farligt for cellen11. FACE-analysen er en metode til valg til bestemmelse af glykogens kædelængdefordeling (CLD). Som afbildet i figur 2 tillader bestemmelsen af CLD konklusionen af den gennemsnitlige kædelængdeværdi af glykogen (ACL), som afspejler strukturen af glykogenpartikler. Animalglykogener med høje ACL-værdier er forbundet med udseendet af unormale partikler. Den subtraktive analyse er en nyttig metode til at sammenligne to glykogenprøver fra forskellige genetiske baggrunde (mutant versus vildtype). Ved at plotte på en logaritmisk skala har CLD’er normaliseret til den maksimale top derimod fordelen ved at sammenligne CLD uafhængigt af en reference og gav os information om den voksende glykogenmekanisme.
Derudover er FACE-analyse en kraftfuld teknik til at karakterisere de katalytiske egenskaber af glykogenmetaboliserende enzymer. For eksempel spalter alle glykogenforgreningsenzymer (1 → 4)-α forbindelser og overfører oligomaltosylgrupper til en (1 → 6)-α position eller forgreningspunkter. Forgreningsenzymer kan skelnes på grund af deres affinitet for polysaccharider (f.eks. Amylopectin, glykogen) og længden af overførte glucaner på trods af den lignende katalytiske mekanisme22. Således kan forskellige kilder til forgreningsenzymer (mennesker, planter, bakterier) karakteriseres og klassificeres gennem en række inkubationseksperimenter og CLD-sammenligninger ved hjælp af FACE-analyse23.
Som nævnt i indledningen er HPAEC-PAD også en alternativ metode til bestemmelse af kædelængdefordelingen18. Begge teknikker kræver fuldstændig hydrolyse af (1 → 6)-α forbindelser eller forgreningspunkter ved hjælp af afgreningsenzymer af isoamylase-typen, før puljen af lineære glucaner adskilles i henhold til deres polymerisationsgrad (DP). HPAEC-PAD-metoden har imidlertid to ulemper sammenlignet med FACE: (1) Det amperometriske pulsrespons falder, når glucankæderne øges, hvilket ikke giver kvantitativ information. Dette massebias-problem kan omgås ved hjælp af HPAEC-ENZ-PAD, der involverer en enzymreaktor efter kolonnen mellem anionbytterkolonnen og PAD24. Kolonneenzymreaktoren hydrolyserer malto-oligosaccharider i glucoserester, hvilket muliggør en konstant puls amperometrisk respons. (2) HPAEC-PAD tillader adskillelse af glucankæder med en polymerisationsgrad på op til 70. Selvom opløsningen er tilstrækkelig til at bestemme CLD for glykogenprøver, adskiller FACE kæder med DPs op til 150, egnet til stivelsesprøver17. Det er vigtigt at huske på, at både HPAEC-PAD og FACE-analyse har fordele og ulemper. For eksempel kræver amineringsreaktionen en fri hemiacetal gruppe til at reagere med APTS’s primære aminfunktion. Dette indebærer, at APTS-mærkning ikke kan anvendes til glucankæder, der mangler reducerende ender (f.eks. Inulin). HPAEC-PAD-metoden kræver ikke tilstedeværelse af reducerende ender. Et andet interessant aspekt af HPAEC-PAD-metoden er, at anionbytterkolonnen kan fyldes med et par milligram lineære glucaner, hvilket muliggør rensning af malto-oligosaccharid med en specifik DP eller 14C-radioaktivt mærket malto-oligosaccharid til enzymatisk assay18,25. Endelig, selvom massespektrometri (f.eks. MALDI-TOF) er en hurtig og følsom teknik til bestemmelse af kædelængdefordeling, synes denne teknik at være mindre reproducerbar. Det overvurderer mængden af lange glucankæder26. Ikke desto mindre kan sidstnævnte bruges til en specifik anvendelse såsom MALDI-billeddannelse for at kortlægge tilstedeværelsen af glykogen på tværs afcellulært væv 27.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af CNRS, Université de Lille CNRS og ANR-tilskuddene “MathTest” (ANR-18-CE13-0027).
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |